基因芯片技术在水稻研究中的应用.doc

本文由rdyg7ycgu6贡献 pdf文档可能在WAP端浏览体验不佳。建议您优先选择TXT，或下载源文件到本机查看。 中国农学通报 第 卷 第 期 年 月 农业生物技术科学 ： ? 基因芯片技术在水稻研究中的应用 王颖姮 ， 邓其明 ， ，李 平 ， （ 四 川 农 业 大 学 水 稻 研 究 所 ， 成 都 ； 四 川 省 农 业 生 物 技 术 工 程 研 究 中 心 ， 成 都 ） 摘 要： 基因芯片是研究生物大分子功能的新技术， 目前此技术已经广泛地应用到植物基因组研究中。 本文对基因芯片技术在水稻的基因表达检测、 特异性相关基因分离、 生长发育研究、 杂种优势预测、 种 子纯度检测以及转基因植株检测与鉴定等方面的应用情况进行了详细的综述。 关键词： 基因芯片； 水稻； 基因表达； 基因检测与分离 中图分类号： 文献标识码： ， ， ， （ ， ； ， ） ： ， ， ， ， ， ， ， ： ， ， ， 随着人类基因组计划 ） 的 （ 逐步 实 施 ， 越 来 越 多 的 动 植 物 、 生 物 基 因 组 序 列 得 微 到测定 ， 和发育过程， 不仅能为其它作物的基因组研究建立模 型， 更为重要的是， 它将为提高水稻产量、 改良稻米品 质、 改善水稻抗逆性和提高其广适性提供分子理论基 础， 因此， 近年来基因芯片技术作为一门新兴的技术 手段， 在水稻研究上得到了飞速的应用与发展。下面 我们将对基因芯片及其在水稻研究上的应用情况进 行详细的综述。 ， 基因序列数据库以前所未有的速度迅速增 长， 生命科学的研究重点也随之由基因序列研究转向 基因功能研究。然而， 怎样去研究如此众多基因的生 物信息及其在生命过程中所担负的功能， 如何研究基 因与基因之间表达和调控的复杂网络关系， 成了全世 界生命科学工作者共同面临的课题。 进行以上的研究 需要能大规模、 高通量检测成千上万条基因在各种生 理状态下表达全貌的研究手 段 ， 基 因 芯 片 技 术 正 是 迎合了这种转变和需要。在植物的研究中， 研究者首 先 将 基 因 芯 片 技 术 广 泛 地 应 用 到 拟 南 芥 中 ， 而 水 稻作为禾谷类作物分子生物学研究的模式植物， 也是 世界上最重要的粮食作物， 通过对其基因结构及功能 的详尽研究， 可以更好地理解和认识高等植物的生长 基因芯片概述 基 因 芯 片 （ ） 又 称 芯 片（ ） 、 微 阵 列 （ ） 、 微 阵 列 芯 片 ） 。它是指在玻片、 硅片等固相 （ 载体上按照特定的序列方式固定上大量序列已知的 片段， 形成 微矩阵。将样品掺入标记分子 后， 与位于微阵列上的已知序列按碱基配对原理进行 杂交， 通过激光共聚焦荧光检测系统检测杂交信号强 基 金 项 目 ： 国 家 ” 划 重 大 专 项 ） 和 四 川 省 科 技 厅 生 物 技 术 攻 关 项 目 ） 资 助 计 “ （ （ 第 一 作 者 简 介 ： 王 颖 姮 ， 女 ， 年 生 ， 在 读 硕 士 研 究 生 ， 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 专 业 。通 讯 地 址 ： 四 川 省 成 都 市 温 江 区 四 川 农 业 大 学 水 稻 研 究 所 。 ： ， 通 讯 作 者 ： 李 平 ， 教 授 ， 博 士 生 导 师 ， 主 要 从 事 水 稻 生 物 技 术 研 究 。 ： 收 稿 日 期 ： 修 回 日 期 ： 。 ? ： 农业生物技术科学 度， 计 算 机 软 件 进 行 数 据 的 比 较 和 综 合 分 析 后 ， 转 化 成不同样本中特异基因的丰度， 获得样品中大量基因 序列特征或基因表达特征等一系列生物信息。 基因芯片分为 芯片和寡核苷酸芯片， 芯片 上的探针分别为 分子或寡核苷酸分子 。通过 异， 从根本上突破了以前研究中一次只能关注 个或 几个基因的瓶颈。 这有助于对植物生长发育的分子机 理进行研究， 为作物育种提供方便快捷的手段。如果 利用基因芯片对比每一个测得的基因和已知基因， 还 可在植物中寻找新的基因。 对杂 交 信 号 检 测 ， 可 以 快 速 鉴 定 靶 基 因 的 存 在 、 量 含 及变化。基因芯片的制作方法主要有两种， 一是 等 使 用 含 有 代 表 约 ， 个 基 因 的 寡 核苷酸芯片分析水稻被微生物侵入后的基因表达情 况， 发现在被能与水稻共生的菌根真菌侵入后， 有 公司采用的原位合成法， 二是将 得到 的 、 核 苷 酸 片 段 等 直 接 点 样 ， 又 叫 合 成 后 点 寡 样。由于基因芯片的高通量、自动化、微型化等特 点 ， 自其诞生之日起就备受关注， 近年 来 ， 以 芯 片 为 研 究 手 段 发 表 的 研 究 论 文 呈 指 数 增 长 ： （ 个基因表达发生变化； 进一步分析发生变化的这 个基因在水稻被致病病原体侵入后的表达情况， 发现大部分基因的表达和菌根真菌侵入后的反应相 似， 只有 的基因 表 达 情 况 不 同 ， 说 明 水 稻 对 微 生 物侵入的反应机制是保守的， 而表达情况不同的基因 则是令水稻致病或者使水稻可以与微生物共生的基 因。 同时， 他们还发现同菌根真菌相关的水稻基因中， 有 的 基 因 也 是 双 子 叶 植 物 同 菌 根 真 菌 相 关 的 基 因， 说明了这两种被子植物对菌根真菌侵入的反应机 制也是相似的。 革 兰 氏 阴 性 菌 产 生 的 鞭 毛 素 能引起一些水稻品种的叶片产生褐色条纹， 同时伴随 细胞程序性死亡， 并诱导一些防御反应的基因表达等 一系列免疫反应 ，。 等 利用含有 ， 个 ） 。 水稻是禾谷类作物研究的模式植物 水稻作为世界上超过一半的人口的主食 ， 是最重 要的粮食作物之一 ， 对我国以及世界农业的稳定发 展有重要影响。在禾谷类作物中， 水稻基因组是最小 的 约 ， 小 麦 的 最 高 ， 约 为 ） ， 这 一 特 （ 点使得相对于其他禾谷类作物而言， 水稻基因组的研 究显得最为方便。同时， 用于水稻的农杆菌介导的有 效的遗传转化方法已经建立 ， 因 而 水 稻 已 经 成 为 禾 谷类作物发育生物学、 分子遗传学及基因组研究的模 式生物。 目前 ， 水稻染色体已完成了序列的测定 行完成图的工作。 等 ， 正在进 克 隆 的 微 阵 列 寻 找 水 稻 培 养 细 胞 中 被 鞭 毛 素 诱导的基因， 发现了有 个基因直接被鞭毛素感受 基因 控 制 ， 也 说 明 在 免 疫 反 应 的 早 期 过 程 中 ， 被 直 接 诱导的基因数目相对较少。 王 丽 华 等 将 ， 个 水 稻 制 作 成 微阵列， 通过比较群体水平上的基因的丰度表达差 异， 并 与 特 定 表 型 进 行 关 联 分 析 ， 明 确 有 众 多 基 因 参 与水稻孕穗、开花和灌浆过程并具有时序表达特征。 分别得到了一批与花器官发育相关、 与雌雄蕊发育相 关、与种子贮藏物相关的基因在群体水平上的表达 谱。 和 等 分别报道了 水稻第 和第 染色体的序列完成图。我国 于 年启动了籼稻基因组测序计划， 并于 年 月在 全世界率先宣布完成了其测序工作并向全世界公布 其测序结果。 另外， 比较基因组研究结果表明禾谷类作物基因 组之间有不少共同性。在水稻中分离克隆到的基因， 将有助于在其他禾谷类作物中进行相应的克隆及功 能研究。通过对水稻基因结构的研究， 可以增加对其 他农作物的生长和发育过程、 农作物与环境的相互作 用以及农作物的抗病和抗虫能力的认识和理解 ， 对提 高作物产量、解决全世界人口的温饱问题有重要意 义。 利 用 基 因 芯 片 对 水 稻 特 异 性 相 关 基 因 进 行 检 测 与分离 寻找和鉴定特异性相关基因是从分子水平上揭 示植物生理机制的一项基础性研究， 利用基因芯片技 术， 可以在植物中快速的鉴定特异性基因。 在农业上， 非生物逆境如高盐胁迫、 低温、 干旱等， 是作物减产的 主要原因 。 因此， 在水稻中， 寻找抗病虫、 抗逆境、 高 产、 质 相 关 基 因 ， 有 利 于 进 行 新 品 种 选 育 和 品 种 改 优 良。 基因芯片技术在水稻研究中的作用 基因芯片对水稻基因表达水平的检测 植物生长发育是一个十分复杂的过程， 涉及到众 多基因的表达和调控。 由于芯片上可以固定成千上万 的探 针 ， 使 众 多 基 因 同 时 检 测 成 为 可 能 ， 不 仅 可 以 比 较在不同条件一个基因组大量基因的转录水平差异， 而且可以对比不同基因组中对应基因的转录水平差 等 利 用 微 阵 列 和 点 杂 交 的方法寻找由寒冷、 干旱、 高盐浓度和 诱导的水 中国农学通报 第 卷 第 期 年 月 农业生物技术科学 ： ? 稻 基 因 ， 发 现 个 基 因 与 上 述 逆 境 相 关 ， 其 中 有 个基因是未报道过的新基因。 经寒冷、 干旱、 高盐浓度 和 诱导的基因分别为 ， ， 和 个， 并发 现水稻对逆境的反应有很强的相关性， 有 个基因 在 种逆境情况下都表达， 表明在不同的抗性反应 中， 存在信号途径交叉或共调控。 个被诱导的基 在 因中， 有 个 ） 与拟南芥逆境相关基因相同， 表 （ 明单子叶植物和双子叶植物对逆境的耐受性和反应 有相似的分子机制。可见， 应用基因芯片技术寻找和 鉴定水稻特异性相关基因， 还能够提供水稻生理过程 的更详细信息。 稻瘟病是水稻重要的真菌病害， 对抗病基因的研 究和克隆， 将有助于阐明水稻对稻瘟病持久抗性的调 控机理， 培育新的抗病品种。饶志明等 抽穗中期和抽穗期表达水平较高， 而在孕穗期阶段较 低， 其可能不仅在水稻花序发育的早期和后期起作 用， 在中期也有重要作用。这些结果将有助于研究水 稻花序的发育机理， 表明基因芯片对水稻生长发育的 研究是个很好的工具。 等 通 过 对 文 库 进 行 大 规 模 测 序， 构建了含约 ， 个水稻非冗余基因的 微阵列进行水稻传粉分子机制的探索， 发现虽然花药 和雌蕊同属繁殖器官， 但是花药中的基因表达模式与 根的基因表达模式却更为相似； 并发现了一系列可能 参与水稻传粉分子控制的基因。 利 用 基 因 芯 片 预 测 水 稻 杂 种 优 势 及 检 测 种 子 真 实性和纯度 杂种优势在农业中得到了广泛的应用 ， 其分子机 理的解析一直是热点问题。基因芯片由于具有并行、 高效等特点， 因此可将发现的强优势标记基因制作成 芯 片 ， 与 未 知 优 势 品 种 的 分 子 进 行 分 子 间 杂 交， 以判断品种间杂交组合优势的强弱。邢俊杰等 以超级杂交稻先锋组合两优培九及其亲本和分离世 代 代的优势集团和负优势集团为材料 ， 采用基因 芯片技术与遗传分析相结合的方法， 对水稻杂种优势 的分子机理以及杂种优势利用中涉及到的重要基 因 认为杂种优势 光温敏核不育基因进行了研究。 的表现与多种代谢途径相关， 差异表达基因涉及代 谢、 发育、 运输和蛋白修饰等多种功能； 遗传差异与表 达谱差异不尽一致， 可能较小的遗传差异可以造成表 达谱的巨大改变， 而有些遗传变异可能没有在表达谱 上表现出来； 研究同时也表明显性表达水平的差异表 达基因的聚合与杂种优势的表现没有相关性。 种子纯度是衡量种子质量的重要指标 ， 采用大田 植物学性状鉴定和同工酶谱带鉴定方法进行种子纯 度检测， 其科学性、 准确性及稳定性有待进一步提高。 而 、 、 、 分子标记技术的发展， 在 植物种子真实性和纯度检测等反面发挥了重大作用。 基因 芯 片 技 术 的 出 现 则 带 来 了 一 种 简 单 、 速 、 确 快 准 的鉴别种子的新方法， 我们可以将真杂交种的特异性 标 记 基 因 制 作 成 芯 片 ， 与 未 知 种 子 的 进 行 杂 交， 判断其真实性和纯度。 构建了 微阵列， 对水稻抗稻瘟病近等基因系的稻瘟病 菌胁迫基因表达谱进行了分析， 发现稻瘟病菌应答基 因分 别 与 防 卫 反 应 、 号 传 递 、 境 胁 迫 和 光 合 作 用 信 逆 及糖代谢等功能相关， 他们还证实了富含甘氨酸蛋白 基 因 （ ） 是 一 个 稻 瘟 病 诱 导 基 因， 为阐明植物抗病机制提供了信息。 另外， 等 对水稻中营养分配相关基 因， 尤其是与水稻灌浆相关的基因进行了研究； 等研究油菜素类固醇 ） 在水稻生长发育中 （ 行使的功能， 找到了一系列油菜素内酯的应答基因， 发现并克隆了增强油菜素内酯作用的基因 。 利用基因芯片进行水稻生长发育的研究 胚胎的发育是植物生长发育过程中最引人注目 的事件， 王盈等 通过显微操作分离到大量水稻胚 胎 ， 利 用 技 术 构 建 了 胚 胎 文 库 ， 结 合 高密度寡核苷酸芯片， 分别对水稻未分化胚胎期、 刚 开始分化胚胎期和正分化胚胎期三个时期的胚胎基 因表达情况进行了研究。结果显示， 在胚胎发育的不 同阶段， 有一定数目的基因呈现出差异表达的性质， 得到了与胚胎发育程序吻合的结果； 并第一次大量发 现了可能与水稻胚胎发生相关的基因， 有参与糖信 号 、 脂 质 的 生 物 合 成 途 径 、 转 录 因 子 （ 包 括 ， 脂 能 ， ， ， 等） 、 肪 酸 代 谢 、 量 代 谢和信号转导蛋白激酶等等。 资 料 显 示 ， 水 稻 、 在 花 发 育 早期和后期阶段都有表达， 在成熟花和心皮中检测到 了表达 利用基因芯片对转基因水稻进行检测 转基因技术的发展给人们的生活带来了更多的 品 机遇 ， 通 过 生 物 技 术 可 使 品 种 改 良 如 产 量 增 加 、 质 提高、 抗性增强等。 但从转基因技术诞生至今， 人类一 直进行着有关转基因技术的食品安全、环境风险、 生 态安全、 社会伦理道德以及国际经济和政治安全等一 。李援亚等 应用寡核苷酸 芯 片 证 实 了 在花 序 发 育 的 早 期 和 后 期 起 作 用 ， 并 发 现 它在孕穗期阶段表达水平尤为突出， 几乎为特异性表 达， 推测其作用更偏重于花发育的早期； 在 ? ： 农业生物技术科学 系列问题的思考及争论。因此， 转基因植物的检测显 的愈 发 重 要 ， 只 有 准 确 地 检 测 转 基 因 食 品 ， 才 能 有 效 的对上市的转基因食品进行监控。 利用基因芯片信息 量大 的 特 点 ， 能 同 时 对 转 基 因 植 物 中 的 启 动 子 、 止 终 子、 报告基因进行检测。和 这些传统检测转基因 植物 的 方 法 相 比 ， 基 因 芯 片 技 术 具 有 灵 敏 度 高 、 异 特 性强， 操作简便、 快速， 自动化程度高及结果准确率高 等特点。 高秀丽等 将转基因水稻中常用的质粒载体 谢 纳 著 ， 张 亮 等 译 生 物 芯 片 分 析 ， 北 京 ， 科 学 出 版 社 ： ， ， ， ： ， ，： ， ，： ， ， ， （ ） ，： ， ， ， ， ，： ， ， ， ， ，： ， ， ， ，： ， ， ，： ， ， ， ， ，： ， ， ， ，： 王 丽 华，水 稻 花 期 特 异 性 调 控 基 因 的 微 阵 列 检 测 和 验 证博 士 论 文 ， 浙 江 大 学 ， 中的 个基因 、 启 动 子 、 、 的特异引物固定于芯片上， 通过引物延伸芯片 法 ， 实 现 了 对 质 粒 中 个 基 因 的 检 测。表明基因芯片能快速、 准确、 高效、 全面的实现对 转基因水稻的检测， 不仅可判断其是否是转基因产 品， 还可对转入的外源基因的种类进行确定。 展望 近年来， 水稻作为禾谷类作物的模式作物， 被广 泛用于植物分子生物学研究中； 而基因芯片作为一种 生物 技 术 平 台 ， 不 仅 已 经 应 用 于 医 学 诊 断 、 物 筛 选 药 和环保等诸多领域，