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吉林农业大学学报 2011年03月吉林农业大学学2011，03 Journal of Jilin Agricultural University E-mail:大花君子兰总生物碱抗肿瘤作用的研究*(20黑体)于妮娜，包海鹰*，何忠梅(4号仿宋)吉林农业大学中药材学院，长春130118 （号楷体）摘 要（小五黑体）：采用MTT法观察大花君子兰总生物碱（简写为TACMR）对体外培养的人肺癌细胞NCI-H446、人胃癌细胞SGC-7901、人乳腺癌细胞MCF-7和人肝癌细胞SMMC-77214种细胞株的增殖抑制作用；用小鼠移植性肿瘤法检测TACMR对小鼠H22肝癌的生长抑制作用，并通过脾指数和胸腺指数等指标综合考察TACMR对肿瘤小鼠免疫机能的影响。体外MTT结果显示：TACMR对NCI-H446、SGC-7901、MCF-7和SMMC-7721均具有明显的细胞增殖抑制作用，且均呈现良好的量效关系，并且TACMR作用于4种不同人肿瘤细胞48 h的IC50值分别为38.55，12.08，8.85，7.04 g/mL；体内试验结果表明，TACMR对H22肝癌生长具有一定的抑制作用。TACMR剂量在34 mg/kg时，抑瘤率为35.2%，脾指数与阳性对照组相比显著增加（P0.01）。TACMR剂量在136 mg/kg时，抑瘤率仅为3.7%，与阴性对照组比较，胸腺指数和脾指数明显减少（P0.01），与阳性对照组比较，胸腺指数明显减少（P0.01）。上述体内外试验结果表明: TACMR具有抗肿瘤作用，同时对免疫功能有一定的影响。（.仿宋）关键词（小五黑体）：大花君子兰；总生物碱；MTT法；H22荷瘤小鼠 （.仿宋）中图分类号（小五黑体）：文献标识码（小五黑体）：A 文章编号（小五黑体）：1000-5684(2011)DOI（小五黑体）: 网络出版地址（小五黑体）：Anti-Tumor Effect of Total Alkaloids from Clivia miniata Regel （小三号Times New Roman 加粗）YU Ni-na ， BAO Hai-ying，HE Zhong-mei（号Microsoft JhengHei）College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China（号Times New Roman）Abstract（号Arial）: In vitro, the inhibitory effects of total alkaloids from Clivia miniata Regel (TACMR) on proliferation of NCI-H446, SGC-7901, MCF-7, and SMMC-7721 were measured by MTT colorimetric assay. The inhibitory effects of TACMR on H22 hepatic cancer was observed in mice with subcutaneous inoculation on the tumor cells and its effect on immunological function of mice bearing tumor by observing the influence to spleen index, thymus index and so on. In vitro, the results of MTT showed that TACMR inhibited proliferation of NCI-H446, SGC-7901, MCF-7, SMMC-7721 and a good dose-effect relationship and the IC50 values on them were 38.55, 12.08, 8.85 and 7.04g/mL. In vivo, TACMR has significant inhibitory effect on H22 tumor cells. The inhibition ratio was 35.2% with the dosage of 34 mg/kg, compared with the positive control group, spleen index increased significantly (P0.01). The inhibition ratio was 3.7% with the dosage of 136 mg/kg, compared with negative control group, thymus index and spleen index decreased significantly(P0.01), compared with the positive control group, thymus index decreased significantly(P0.01). In tumor inhibitory test, it was shown that TACMR has strong inhibition on tumor cells and certain impact on immunological function. （10号Times New Roman）Key words（号Arial）: Clivia miniata Regel; total alkaloids; MTT; H22 tumor bearing mice（10号Times New Roman）Journal of Jilin Agricultural University 2011 ，March大花君子兰（Clivia miniata Regel.）为石蒜科(Amaryllidaceae)君子兰属（Clivia）多年生常绿草本* 基金项目（小五 黑体）：长春市惠宝君子兰科技养殖及药理活性研究项目（2010040101）（小五 宋体）作者简介（小五 黑体）：于妮娜，女，在读硕士，研究方向：生药学。（小五 宋体）收稿日期（小五 黑体）：2010-10-24 网络出版时间（小五 黑体）：* 通讯作者（小五 宋体）植物，又名剑叶石蒜，大叶石蒜，达木兰。君子兰原产于南非，20世纪初传入中国，我国栽培的品种以大花君子兰为主。吉林省长春市于1984年将君子兰定为长春市市花。君子兰含有生物碱类、花色苷类、黄酮类、氨基酸类、无机元素等多种化学成分1-4。近年来的研究表明，君子兰水提液具有强心、抗心律失常作用5-6。君子兰总生物碱具有抗菌、抗炎、抗氧化和保护肝肾的作用，同时可抑制小鼠肝癌实体瘤的生长7-8。从根和叶中分离得到的石蒜碱，具有抗病毒、抗癌、抗寄生虫和抗疟疾作用9。目前，对TACMR体外抗肿瘤作用及体内抗肿瘤对免疫系统的影响研究报道甚少。本研究采用MTT法观察TACMR对体外培养的人肺癌细胞NCI-H446、人胃癌细胞SGC-7901、人乳腺癌细胞MCF-7和人肝癌细胞SMMC-7721 4种细胞株的增殖抑制作用；用小鼠移植性肿瘤法检测TACMR对小鼠H22肝癌的生长抑制作用，并通过脾指数和胸腺指数等指标综合考察TACMR对肿瘤小鼠免疫机能的影响，为更好的开发利用大花君子兰资源以及临床应用等提供理论依据。（10号 宋体然后Times New Roman）1 材料与方法（小四 黑体）1.1 供试材料（五号 黑体）大花君子兰(Clivia miniata Regel.)，购自长春惠宝君子兰养殖基地，由吉林农业大学图力古尔教授鉴定。人肺癌细胞NCI-H446、人胃癌细胞SGC-7901、人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞SMMC-7721和小鼠H22肝癌瘤株，均由吉林省肿瘤医院提供。昆明小鼠，雌性，体重202g，购于吉林大学实验动物中心。1.2 试剂与仪器CO2培养箱（NAPCO法国），酶标仪（芬兰Lab systems公司），注射用环磷酰胺 (CTX，山西普德药业有限公司，产品批号20080602)，5-氟尿嘧啶（5-Fu，购于吉林省肿瘤医院），二甲基亚砜DMSO (Amersco)，胎牛血清（购于长春生物制品研究所），胰蛋白酶（购于上海化学试剂厂），四甲基偶氮唑盐（MTT，Sigma公司），离心机（美国SORVALL公司），KX-21N全自动血液分析仪（日本SYSMEX公司）。1.3 TACMR的制备 取大花君子兰根粉末1.5kg，用95%乙醇3 000mL加热60回流提取8h，重复3次，合并提取液，过滤，减压浓缩至浸膏，然后用0.01mol/LHCl溶解，静置24h，取上清液，用等体积的氯仿反复萃取除去杂质，萃取后的酸水溶液用氨水调至pH 10，用等体积的氯仿再次萃取，至与生物碱化学检识试剂碘化铋钾、碘化汞钾、硅钨酸反应均呈阴性。萃取液减压浓缩得黄色固体粉末，与生物碱化学检识试剂碘化铋钾、碘化汞钾、硅钨酸反应均呈阳性，即为TACMR，备用。 1.4 体外试验方法1.4.1 细胞培养（五号 楷体） 将肿瘤细胞接种于含10%胎牛血清、100U/mL青链霉素的RPMI-1640培养液中，放入37、5%CO2培养箱培养，待细胞进入对数生长期后用0.25%胰蛋白酶消化传代培养。1.4.2 药物配制 受试药分8个浓度，依次为200，100，50，25，12.5，6.25，3.12，1.56g/mL；阳性药5-Fu浓度为25gmL-1。1.4.3 MTT试验步骤 将细胞以1105个/mL浓度接种于96孔板，每孔100L，37、5%CO2饱和湿度培养24h后，按设计浓度加受试药，每个剂量4个平行孔，每孔加药量100L。再培养72h后，每孔加入MTT液20L（浓度为5gL-1），继续培养4h，弃去所有上清，每孔加150L DMSO，微量振荡器振荡10min，置酶标仪上测定各孔在570nm波长处吸光度值。细胞增殖抑制率（%）= (阴性对照组A值-受试药组A值)/阴性对照组A值100。药物的半数抑制量IC50=lg-1Xm-i(P-0.5) ，其中Xm为设计的最大浓度的对数值；i为各浓度倍比浓度的对数值；P为各组生长抑制率之和；0.5为经验常数。1.5 体内试验方法选择腹腔接种68d生长良好的H22肝癌小鼠，颈椎脱臼处死，无菌条件下抽取腹水，用生理盐水稀释成细胞个数为1106/mL的细胞悬液，接种于小鼠右腋皮下，每只0.1mL。然后随机分成6组，即空白组，阴性对照组，阳性对照组，TACMR高、中、低剂量组，即136，68，34 mg/kg（相当于LD50的1/25，1/50，1/100），每组10只。次日开始每天灌胃给药1次，连续12d。阳性对照组按20mg/kg浓度、每隔1d腹腔注射CTX，体积为0.1mL/10g。第13d颈椎脱臼处死小鼠，摘眼球取血0.51.0 mL，抽取400L血液，转移到真空抗凝管中，使用KX-21N全自动血液分析仪对白细胞数进行检测。将取血后小鼠处死，摘取瘤块、胸腺和脾，分别称重并计算抑瘤率和脾指数、胸腺指数。肿瘤抑制率=（阴性对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）/阴性对照组平均瘤重100%。胸腺指数为每克体重中胸腺的毫克数，脾指数为每克体重中脾脏的毫克数。1.6 统计方法 测定指标采用s表示，所有数据由SPSS18.0统计软件进行One-Way ANOVA分析，并计算相应的统计学参数。2 结果2.1 TACMR对体外培养的4种不同人肿瘤细胞增殖的影响TACMR对体外人肺癌细胞NCI-H446、人胃癌细胞SGC-7901、人乳腺癌细胞MCF-7和人肝癌细胞SMMC-7721均具有很强的细胞增殖抑制作用，并呈良好的剂量-效应依赖性。TACMR作用于4种不同人肿瘤细胞48h的IC50值分别为38.55，12.08，8.85，7.04g/mL（图1）。图1 MTT法检测TACMR对4种不同人肿瘤细胞的增殖抑制率（小五 黑体）Fig. 1. Effect of TACMR on 4 different human tumor cells proliferated by MTT（小五 Arial Narrow）2.2 TACMR对H22肝癌荷瘤小鼠的体内肿瘤抑制 作用2.2.1 TACMR对肿瘤生长的抑制作用 体内试验结果（表1）显示，TACMR对H22荷瘤小鼠肿瘤生长具有一定的抑制作用。阳性对照组与给药组的平均瘤重均低于阴性对照组。在给药剂量为34mg/kg时，抑瘤率为35.2%，与阴性对照组相比，差异显著（P0.05）。表1 TACMR对H22荷瘤小鼠的抑瘤率（小五 黑体）Table 1. Anti-tumor action of TACMR on H22 tumor of mice（小五 Arial Narrow）组别（六号）Group剂量/(mgkg-1)Dose瘤重/gTumor weight抑瘤率/%Inhibition ratio阴性对照组Negative control group0.930.31阳性对照组Positive control group200.450.26*51.3TACMR1360.890.413.7TACMR680.750.3718.9TACMR340.600.29*35.2注：与阴性对照组相比“*”P0.05，“*”P0.01（六号 宋体）Note: Compared with negative control group “*”P0.05, “*”P0.05）见表2。表2TACMR对H22荷瘤小鼠免疫器官的影响(n=10)Table 2. Effects of TACMR on immune organs in H22 tumor bearing mice(n=10) 组别 Group 剂量/(mgkg-1)Dose脾指数/(mgg-1)Spleen index 胸腺指数/(mgg-1) Thymus index白细胞数(109L-1)WBC空白组Blank group4.300.03*3.75 0.0413.760.48 阴性对照组 Negative control group10.0110.590.66阳性对照组Positive control group204.730.04*2.730.0120.900.86TACMR1364.270.07*1.310.014* 0.620.80TACMR686.060.051.560.014* 0.800.58TACMR347.320.033.090.012 0.970.23注：与阴性对照组相比“*”P0.05，“*” P 0.01；与阳性对照组相比“”P 0.05，“”P 0.01Note: Compared with negative control group “*” P 0.05, “*” P 0.01; compared with positive control group “”P 0.05, “”P 0.013 讨 论笔者采用MTT法观察了TACMR对体外培养的4种不同人肿瘤细胞的增殖抑制作用，用小鼠移植性肿瘤法检测了TACMR对小鼠 H22肝癌的生长抑制作用，同时观察了TACMR对肿瘤小鼠免疫器官的影响。通过体外试验发现，TACMR能显著抑制NCI-H446、SGC-7901、MCF-7、SMMC-7721细胞的增殖，量效关系明显。一般情况下，当药物浓度10g/mL，其抑制率达到50%以上时，药物对该肿瘤细胞株就会产生细胞毒作用10。TACMR在浓度为6.25 g/mL时，对SGC-7901、MCF-7、SMMC-7721细胞的抑制率已超过50%，推测TACMR对肿瘤细胞具有较强抑制作用可能与其细胞毒作用有关。体内试验结果表明，TACMR对荷瘤小鼠H22肝癌细胞具有一定的生长抑制作用，抑瘤率可达35.2%，但抑瘤率与剂量呈负相关，可能与其抑制免疫功能有关。TACMR对免疫器官指数也有一定影响。胸腺是T细胞分化成熟的免疫中枢器官。从骨髓迁入的淋巴样祖细胞在胸腺经过复杂的分化发育过程，最终成为功能性CD4+细胞及CD8+细胞，定位于外周淋巴器官及组织发挥作用11。脾是机体的外周淋巴器官即成熟的淋巴细胞定居及外来抗原发生免疫应答的场所，脾中B淋巴细胞，与体液免疫密切相关12。本研究中，在给药剂量为136mg/kg时，抑瘤率为3.7%，脾指数、胸腺指数和白细胞数明显降低，并且胸腺指数与阴性对照组和阳性对照组相比，差异极显著（P0.01)，其原因可能与TACMR中含有苄基苯乙胺类生物碱有关，此类生物碱的分子骨架主要由苄基和苯乙胺两部分组合而成13。TACMR中以石蒜碱型生物碱为主，并且石蒜碱的含量最高，石蒜碱能导致小鼠的胸腺萎缩，同时能使中性粒细胞和嗜酸性细胞减少，并对HIF-1Mpha因子诱导的转录活性有抑制作用14-15。随着剂量的增大，脾指数、胸腺指数和白细胞数逐渐减少，说明给药剂量的增大对免疫功能存在一定的影响，可能会导致T和B淋巴细胞减少。因此，只有选择合适的剂量，才能使TACMR发挥其较强的抑瘤作用，然而TACMR中所含的石蒜碱对小鼠肝癌细胞的抑制作用不明显16，暗示可能含有其他具有肿瘤抑制作用的成分，其有效成分及详细机理有待于进一步研究。参考文献:（五号 黑体）1李树殿.君子兰化学成分及药理学研究进展J.吉林农业大学学报,1986,8(4):36-44.（六号 宋体然后Times New Roman）2Antonio Evidente, Amina H Abou-Donia, Fikria A Darwish, et al. Nobilisitine A and B, two misname-type alkaloids from Clivia nobilisJ.Phytochemistry, 1999, 51(8): 1151-1155.3Yumi Sakaguchi,Yuki