组织工程.ppt

1 答案是四个字 提示一 时代杂志于2000年将其列为二十一世纪十大热门工作的榜首 提示二 哪吒 提示三 壁虎 提示四 预定器官提示五 再生医学 组织工程TissueEngineering 3 哪咤 的故事 哪咤击毙龙王三太子后 四海龙王前来复仇 哪咤为救父 遂自刎 削骨还父 剔肉还母而身亡 其师尊太乙真人以莲花堆成哪咤身形 炼成莲花化身之躯以使哪咤复活 在21世纪的今日 各项科技突飞猛进 莲花化身 这种组织器官再生的说法 已不再只是出现在小说中遥不可及的神话 4 自然界中的器官再生 壁虎遇到敌人袭击时会自断尾巴 趁敌人陶醉在香 尾 大餐时 一溜烟地跑掉 不过一段时间后 全新的尾巴又会自动长出来 海星砍成两半丢入海中 海星不但不会死亡 且每一半都可长成独立的个体 这种特性叫做 再生 拥有这般器官再生的神奇功能 实在令人称羡 近代科学家们凭借着一股 临渊羡鱼 不如退而结网 的坚定信念 发挥 仿效自然 的巧思 重建受损的人体组织 这就是 组织工程 的主要精髓 5 治疗医学预防医学再生医学 6 自体组织移植异体组织移植人工代用品 免疫排斥反应供体数量不足道德伦理制约 器官移植 组织工程 7 传统上 外科医生对于受损组织的处理 都是以手术重建的方式进行 也就是对患处直接作手术缝合或利用人体组织移植以达修复的目的 二次大战期间 由于科技知识爆炸 以及各学科间的相互整合 科学家提出了 仿效自然 的想法 希望以人工制造方式 创造出与人体正常器官相同的取代物 使用人工物质如合成高分子等 作为取代物的人工器官与生医材料 这一波风潮在1970年代达到高峰 科学家们发现 人工合成的物质若长久置放在人体内 会有慢性发炎等免疫排斥问题产生 新一代的思维模式 尝试结合人体组织移植与人工材料修复的优点 开启了组织工程的新纪元 8 9 引起广泛重视与讨论的 再生医学 可以大致分为两个部分 第1个部分主要是 干细胞疗法 利用多才多艺的干细胞来补充因为疾病或受伤无法工作的细胞第2个部分是 组织工程 10 若有一位小耳症的病人想要重建缺陷的耳朵 这时可以用可分解材料加工做成这位病人正常耳朵的样子 就是耳朵 支架 然后在病人的耳朵上挖个几乎看不见的小伤口 取出一点耳朵软骨细胞 在体外复制大量的软骨细胞做为种子 再播种回到耳朵 支架 中 种到耳朵 支架 中的软骨细胞若在体外有合适的环境 经过一段时间 例如一 两个月 就会长出真正的耳朵软骨 这时再把长出来的再生组织移回到病人的身上 11 在这个过程中 工程师能为细胞做些什么事呢 首先 材料工程师 高分子科学家必须先对承载细胞的 支架 材料做出完美的设计 让这些细胞能高高兴兴地在 支架 材料上面成家立业 例如 支架 材料上孔洞的大小得让细胞播种得进去 也才能进一步复制及生长 此外 支架 材料在细胞成家立业 生长出真正的组织后 必须功成身退而分解掉 这个过程若控制不当 细胞就会拒绝工作 组织再生就无法成功 12 另一方面 由于 支架 材料上面还没有血管帮细胞运送营养与排除废物 因此化学工程师 机械工程师这时要介入帮忙 化学工程师要设计与身体情况相仿的动态流体系统 例如利用外在流场等 促进细胞在 支架 材料中营养的进入与废物的排除 机械工程师要计算出动态系统 如流场 中是否具有能促进细胞辞能健全的合适力场 还要进行良好的支架外观设计与制造等工作 这些都会使得细胞与 支架 材料共同培养 长出组织的过程更加顺利 13 支架材料上面改播种干细胞 在很多情况下发现干细胞较原组织细胞具有更高的活性 会使再生出来的组织在功能上更接近原来想要的组织 但是干细胞对于支架材料也更加挑剔 材料的选择往往影响干细胞的分化与命运 有人更把纳米材料的理念镶入局支架材料的设计中 希望利用纳米材料具有仿生的特性来加强干细胞的性质 这些研究也引发了许多结合纳米医学与再生医学的联想 14 同样地在支架材料与干细胞共同培养系统中的力场与流体场的设计也会影干细胞的未来走向 生物机械学家推测 干细胞虽然多才多艺 具有分化成不同组织细胞的特性 但若施以压力比较容易变成软骨 改用切力比较容易变成硬骨 施以拉力则容易变成韧带等 这些知识的建立需要庞大的研究成果为基础 15 想象一下骨折无法愈合 可能面对一辈子的疼痛与行动不便 骨科医师在骨折缺损处 填上一种含生长因子的接合剂 结果骨折处神奇地愈合了 肝脏病人需要新的肝 医生不需烦恼移植肝脏来源的取得 直接植入病人自己的干细胞进行修补 就能恢复正常的肝功能 这些场景都已不再是科幻电影中的虚拟情节 借着组织工程 人体组织与器官的病变与缺损 都可以像汽车进保养厂般换上新的零件 而恢复正常的功能 16 组织工程基本概念 应用工程学和生命科学的原理与方法 将在体外培养 扩增的功能相关的活细胞种植于多孔支架上 细胞在支架上增殖 分化 构建生物替代物 然后将之移植到组织病损部位 达到修复 维持或改善损伤组织功能一门科学 17 组织工程学是集生物工程 细胞生物学 分子生物学 生医材料 生物技术 生物化学 生物力学以及临床医学于一体的一门交叉学科 18 人工组织或器官修复或弥补人体组织或器官缺损检测 观察 诊断 19 组织工程的背景 由于移植器官来源严重的缺乏 早在一九八0年代美国麻州总医院的外科医师乔瑟夫 韦肯逖 JosephVacanti 与麻省理工学院的化工系教授罗伯特 蓝格 RobertLanger 便已想到或许应该像制造汽车零件般的 利用科学的方法制造人体组织与器官的零件 以克服器官捐赠来源短缺的窘境 因此他们结合了医学背景与工程材料知识携手合作 研发能修复人体病变组织与器官的零件 这就是组织工程的开始 20 RobertLanger教授培养的长了人体耳朵组织的老鼠 21 一九九二年他们研究一种能被生物体分解的多孔状结构高分子材料 并在其上培养软骨细胞 由于高分子材料的多孔状结构能让培养液与代谢物自由穿透 培养的细胞因此能着床且增生 形成新的软骨组织 他们也成功地在老鼠背上培养出人耳形状的软骨 一九八七年美国国家科学基金会提出并界定组织工程为重点科技 并于次年在加州太后湖举行了第一次组织工程会议 一九九零年举办了第一届组织工程学术研讨会 而专业期刊 组织工程 TissueEngineering 也在一九九五年正式发行 美国与世界的组织工程学会也分别于一九九六与一九九八年正式成立 自此组织工程已成为生物技术研究领域的明星 22 定义 1988年正式定义为 应用生命科学与工程学的原理与技术 在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上 研究开发用于修复 维护 促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科 23 基本原理和方法是将体外培养扩增的正常组织细胞吸附于一种具有优良细胞相容性并可被机体降解吸收的生物材料上形成复合物 然后将细胞 生物材料复合物植入人体组织 器官的病损部位 在作为细胞生长支架的生物材料逐渐被机体降解吸收的同时 细胞不断增殖 分化 形成新的并且其形态 功能方面与相应组织 器官一致的组织 从而达到修复创伤和重建功能的目的 24 种子细胞生物材料组织 器官构建组织工程的临床应用 25 核心 建立由细胞和生物材料构成的三维复合体 三要素 种子细胞 Cell 增殖 分化 自组装成组织和器官信号因子 细胞因子或生长因子 Growthfactor 调节细胞的增殖和分化支架材料 scaffold 细胞外基质 Extracellularmatrix ECM 支撑和指导细胞增殖 分化 26 组织工程三大组件 细胞 支架 讯号 27 组织工程的步骤与方法将细胞取得 快速培养后再植入支架 使细胞依着支架材料的形状长出新的再生组织 最后长好的组织再移植入人体 28 支架就像是果农种植葡萄时所搭起的棚架 细胞就是种下的种子 而生长因子就好比所施予的肥料 想要针对受损组织进行修复动作或实现人造器官的美梦 需要这三大要素之间巧妙的配合 针对人体中不同部位的组织需要 研拟出适合组织器官再生的策略 以达成组织工程造福人群的目的 29 所谓体外的方式 即在实验室内以人工细在体外培养出人体组织或器官后 再植入病人缺损的部位 30 体内的方式 则仅提供人工细胞外间质与生长因子 植入病人缺损的部位后 病人体内的细胞会迁入 增生 而完成修复的动作 31 支架 细胞的家 想要让细胞长成我们所预期的器官构造 如果缺乏细胞的立足点 也就是作为细胞生长温床的 支架 是一件不可能的任务 组织工程利用特殊的生物高分子材料建构出三度空间的立体框架 让植入的细胞可以在其中生长并增生 支架的功能不仅仅当作细胞生长的框架结构 更可以进一步地控制引导细胞朝特定的方向生长 分化 32 为什么细胞需要一个家 现代科技可以帮细胞盖房子吗 33 为什么细胞需要一个家 人类是由一个胚胎细胞不断地分裂 成长 分化而成 共同功能的细胞组成组织 不同群的组织形成有特殊功能且结构复杂的器官 而器官连接形成系统 如消化系统 各种系统的整合运作使生理机能发挥效果 如此构成一个完整的身体 组织工程是依循人体组织生长发育的模式 提供近似体内的生长环境和营养给未完全分化的细胞如干细胞 使这些细胞分裂 成长 及分化成具有特定功能的细胞 进而繁衍成所需的组织 甚至培养不同功能的组织 以形成具特殊功能的器官 解决缺乏移植组织或器官的问题 34 组织再生的关键点之一是 细胞要在何处生长及分化成我们所需的组织 一如胚胎细胞在妈妈的肚子里健康地成长茁壮 我们也必须提供一个舒适 安全的居住环境 让细胞能在里面成长 此一结构就是在组织工程中所使用的 支架 scaffold 我们可以把支架想象成一个房子 或是一个温室 可以将其放置在实验室或是体内 让细胞在支架中繁殖分化 形成组织 再移植进入患者身体 或者直接在患者体内繁殖分化成所需的组织 若此一支架的外型 尺寸与待修补的组织一样 则所培养出的组织将很适合修补缺陷组织 这也是组织工程重要的一环 但是 怎样才是细胞理想甜蜜的家呢 35 理想的家 想想心目中一个舒适又安全的家是什么样子的吧 家的必要条件是要有坚固的梁柱 抵挡自然环境的威胁 有舒适的居家环境 可以休憩 有足够的水 电 以维持生活的基本机能 还有四通八达的格局 能够来去自如 36 支架必须有许多彼此连接的孔洞的要求 以便细胞和营养液流通 这些孔洞的大小 必须要能让细胞通过 因为要让细胞附着在支架上繁衍成长 所以支架的材料必须是没有毒性 具有生物兼容性 才不会伤害细胞及患者 支架的表面需适合细胞附着 才能使细胞 安居乐业 37 支架若能在细胞繁殖的期间 同时分解成对人体无害的物质 材料的选用仍须考虑适当的分解速率 以配合细胞的繁殖速率因为支架终究将移植入体内 所以必须具备一定的强度 不然整个结构可能受体内各种外力的影响而垮掉 所以 在考虑孔洞大小的时候 不可忽略整个结构的强度 38 组织工程支架的要求 符合生物安全性要求合适的可生物降解吸收性良好的生物兼容性 即没有严重的免疫排斥问题 合适的孔尺寸 高孔隙率和相连的孔形态特定的三维外形高表面积和合适的表面理化性质与植入部位组织力学性能相匹配的结构强度 支架设计及制备技术 材料表面工程 39 无论所使用的材料为何 皆具有两个共通的特性 首先是可塑性 可按照不同的组织器官构造 塑造出我们所想要的形态 其次是支架内部的孔洞结构 它就像是一间间的小房间 细胞植入后 如同攀岩一般先贴附在房间的墙壁上 然后慢慢地往房间中央伸展 最后细胞及其制造出的细胞外基质形成组织而占满了整个房间 细胞彼此间穿墙而过形成联合的整体 长成我们所要的器官 40 41 42 43 44 45 46 支架 scaffold 成分胶原蛋白 蛋白多糖 糖胺聚糖 层连蛋白和弹性蛋白等作用影响细胞形态促进细胞迁移调节细胞增殖和分化 47 伟大建筑师之路 在决定了多孔性的支架架构后 接下来就是如何盖好符合此一架构的漂亮房子啦 罗马不是一天造成的 更何况我们的细胞先生要求满高的 只好想尽一切办法 为他盖个舒适的家啦 因为孔洞的大小只有0 05 0 2厘米且需要互通连接 所以我们必须利用一些特殊的方法 才能盖出好房子 这也是身为一个支架建筑师的最大挑战 48 支架设计及制备技术 支架材料天然高分子材料合成降解聚合物生物陶瓷生物复合材料 49 天然高分子材料 蛋白质支架胶原明胶多糖支架海藻酸盐壳聚糖透明质酸蛋白质 多糖支架 50 冷冻干燥 LieMa etal Collagen chitosanporousscaffoldswithimprovedbiostabilityforskintissueengineering Biomaterials2003 24 4833 41 参数 溶液浓度 冷冻温度 冷冻时间和冷冻速率等 51 浸没沉淀相转化 上层 致密 Fwu LongMi etal Fabricationandcharacterizationofasponge likeasymmetricchitosanmembraneasawounddressing Biomaterials2001 22 165 73 52 冷冻 凝胶 Ming HuaHo etal Preparationofporousscaffoldsbyusingfreeze extractionandfreeze gelationmethods Biomaterials2004 25 129 38 温度低于溶液凝结点 Morphologyofthechitosanandalginatescaffolds 53 合成聚合物材料 聚丙烯酸及其衍生物聚乙二醇及其共聚物聚乙烯醇聚交酯聚乳酸 PLA 聚 D L 乳酸 co 乙醇酸 PLGA 聚乙交酯 PGA 等 54 致孔剂致孔 形成气体的盐致孔水溶性致孔剂致孔冰晶致孔 GuopingChen etal Developmentofbiodegradableporousscaffoldsfortissueengineering MaterialsScienceandEngineering 2001 C17 63 9 Morphologyofcross sectionsofPLLAsponges 55 热致相分离 TIPS 均向聚合物溶液 高温 低温淬火热力学状态参数 聚合物浓度 溶剂 非溶剂组成 淬火过程及添加剂 Fig 2 SEMimagesofthecrosssectionofmorphousPLGAfoamsasafunctionofcoarseningtime Thefoamswerepreparedbycoarsening9 w v polymersolutionat43Cfor0min a 2min b 10min c andthenquenchingbyliquidnitrogen 56 乳液冷冻干燥 WhangK etal Anovelmethodtofabricatebioabsorbablescaffolds Polymer1995 36 837 42 57 超临界二氧化碳 SCCO2 无残留溶剂制备非晶相聚合物支架参数 压差 减压速率 超临界流体技术 58 其它形态支架的制备技术 微球基质静电液滴 乳化纤维支架静电纺丝管状支架无纺网粘合溶剂流涎和挤塑 59 欢迎光临 支架建好了 主角上场啦 为避免免疫系统的排斥 一般使用需要移植组织者的细胞 将细胞以滴入或注射的方式 植入支架中 细胞就可以附着在支架表面上 细胞所需的营养可藉由孔洞输送至细胞处 而细胞也可经由外界的各种刺激 加速成长与布满整个支架 形成我们所需要的组织 而支架周遭的微血管亦可以侵入支架内 以确保养分的供给 由于使用可降解的生医材料 因此整个支架结构会慢慢地分解 配合细胞的繁殖速率 可使新生成的细胞填补分解掉的支架部分 等支架完全分解成无害的物质之后 原本支架所占有的体积也被细胞所填补 所培养的组织如同所期望的组织 所具备的功能也一样 60 细胞 组织再生的关键 组织工程的最终目的是让细胞在体外生长分化为功能性的组织器官 采集少量的自体细胞加以培养 在体外大规模地增殖 再运用于体内器官的修复上 因此细胞是组织工程策略能否奏效的重要功臣 细胞的类型大致上可分为两种 已分化完全的 成熟细胞 以及具有分化成其它细胞能力的 干细胞 成熟细胞的来源主要分为自体及异体细胞 自体细胞是最为理想的细胞来源 因为不会产生免疫排斥的问题 虽然近几十年间 体外培养细胞的技术已有令人瞩目的进展 但仍有许多关键性的难题尚未突破 例如 如何有效地促进成熟细胞在体外的增生能力 以及细胞取得来源受限等问题 将是组织工程应用发展的一大绊脚石 61 干细胞 研究的热潮 为组织工程的前景带来一线曙光 藉由诱导干细胞分化的研究 可以解决细胞来源不足的问题 且干细胞具有在体外无限制增殖的特点 将解决组织工程的 细胞荒 问题 虽然目前对于干细胞的研究尚未成熟 且针对 胚胎干细胞 方面的研究因牵涉到伦理的问题而反对声浪不断 干细胞不仅只是存在于胚胎当中 在成熟的人体内依然可发现其踪影 比方说骨髓中就含有造血干细胞与间叶干细胞 在不久的将来 会有类似 细胞银行 的机构出现 专门提供各式各样的人体细胞 或培育客户的干细胞使其分化成为所需细胞 作为组织器官修复的重要组件 62 干细胞的定义 干细胞 stemcell 是指具有无限或较长期的自我更新能力 并能产生至少一种高度分化子代细胞的细胞 根据这一定义 在个体发育的不同阶段以及成体的不同组织中均存在着干细胞 只是随着年龄的增长 干细胞的数量逐渐减少 其分化潜能也逐渐变窄 在干细胞的发育过程中 还有一种中间类型的细胞称为祖细胞 progenitorcells 祖细胞也具有有限的增殖和分化能力 与干细胞不同的是 祖细胞没有自我更新能力 它在经过几轮细胞分裂周期后产生的两个子代细胞均为终末分化细胞 terminaldifferentiatedcells 63 64 65 红细胞 血小板 中性粒细胞 巨噬细胞 嗜曙红细胞 肥大细胞 浆细胞 T细胞 66 干细胞的分类 根据发生学来源分类 根据分化潜能分类 根据干细胞组织发生的部位进行分类 目前 已经从许多组织或器官中成功地分离出干细胞 其中包括 胚胎干细胞 造血干细胞 骨髓间充质干细胞 神经干细胞 肌肉干细胞 成骨于细 内胚层干细胞 视网膜干细胞及胰腺干细胞等 67 根据发生学来源分类 胚胎干细胞 embryonicstemcell ESC 成体干细胞 somaticstemcell 68 胚胎干细胞 胚胎干细胞是指由胚胎内细胞团 innercellmass ICM 或原始生殖细胞 primordialgermcell PGC 经体外抑制培养而筛选出的细胞 胚胎干细胞还可以利用体细胞核转移 somaticcellnucleartransfer SCNT 技术来获得 胚胎干细胞具有发育全能性 在理论上可以诱导分化为机体中所有种类的细胞 胚胎干细胞在体外可以大量扩增 筛选 冻存和复苏而不会丧失其原有的特性 69 成体干细胞 成体干细胞是指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞 这种细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞 成体干细胞存在于机体的各种组织器官中 成年个体组织中的成体干细胞在正常情况下大多处于休眠状态 在病理状态或在外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力 70 根据分化潜能分类 全能干细胞 totipotentstemcell 多能干细胞 pluripotentstemcell 单能干细胞 unipotentstemcell 71 全能干细胞 具有自我更新和分化形成任何类型细胞的能力 有形成完整个体的分化潜能 如胚胎干细胞 具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力 可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型 进一步形成机体的所有组织 器官 72 多能干细胞 多能干细胞具有产生多种类型细胞的能力 但却失去了发育成完整个体的能力 发育潜能受到一定的限制 例如 造血干细胞可分化出至少12种血细胞 骨髓间充质干细胞可以分化为多种中胚层组织的细胞 如骨 软骨 肌肉 脂肪等 及其他胚层的细胞 如神经元 科学家们目前趋向于将分化潜能更广的干细胞称为多潜能干细胞 pluripotentstemcell 如骨髓间充质千细胞 而将向某一类型组织的不同细胞分化的干细胞称为多能干细胞 multipotentstemcell 如造血干细胞 神经细胞等 73 单能干细胞 也称专能 偏能干细胞 常被用来描述在成体组织 器官中的一类细胞 意思是此类细胞只能向单一方向分化 产生一种类型的细胞 在许多已分化组织中的成体干细胞是典型的单能干细胞 在正常的情况下只能产生一种类型的细胞 这种组织是处于一种稳定的自我更新的状态 然而 如果这种组织受到伤害并且需要多种类型的细胞来修复时 则需要激活多潜能干细胞来修复受伤的组织 74 干细胞研究中的主要问题 维持胚胎干细胞未分化状态的机制干细胞定向诱导分化的调控机制获得高数量和高纯度的分化细胞 为组织工程提供种子细胞人胚胎干细胞可以形成各种类型的细胞和简单的组织 但是否具有形成复杂器官 移植排斥问题干细胞用于临床治疗的安全性问题干细胞可塑性的机制是怎样的 75 讯息因子 所罗门之钥 如果单单只靠支架及细胞的配合 要想完成组织再生的艰巨任务 可说是 万事具备 只欠东风 唯有合适的讯息因子加入 才能诱导细胞在支架材料上正确地分化 迁移及生长 最后才有功能性正常的组织器官诞生 不同的细胞类型 施以相当的讯息因子 才能够启动组织再生的过程 76 讯息因子指的是什么呢 帮助细胞黏贴在支架上的贴附因子促进细胞正常生长的生长因子引导干细胞分化为想要的细胞分化因子 77 刺激组织器官再生的讯息因子并不局限于有形的分子 人体的细胞常置身于流场如血管之中 或必须承受相当的负荷如骨头 因此 其它如机械应力或超音波等物理讯号