共振光散射法测定核酸的含量.doc

第一部分 文献综述1.1 共振光散射技术的原理1.1.1 光的散射光散射现象广泛存在于光与粒子的作用过程中，是指当光通过介质时在人射光方向以外的各个方向上所观察到的光现象。它源于光电磁波的电场振动而导致的分子中电子产生的受迫振动所形成的偶极振子。根据电磁理论，振动着的偶极振子是一个二次波源。它向各个方向发射的电磁波就是散射波1。光散射与介质的不均匀性有关。除了真空之外的其它所有介质都有一定程度的不均匀性。从而产生散射光。只是由于介质中粒子大小不同。产生不同种类的散射。当介质中粒子直径远大于人射光波长时，产生的散射可看成是反射和折射。如果介质中粒子直径与人射光波长相近，便产生了Tyndall散射；如果介质中粒子很小，如时，便产生以Rayleigh散射为主的分子散射2。分子散射是由于分子热运动造成的局部密度涨落引起的。分子散射比Tyndall散射要弱得多。但是，即便十分纯净的液体和气体都能产生分子散射。根据人射光和散射光波长的不同，光散射又可以分为弹性光散射、非弹性光散射和准弹性光散射。其中弹性光散射又称为经典散射或静态散射。Rayleigh散射是的弹性散射，浑浊介质的Tyndall散射和透明介质的分子散射都是弹性散射。发射光波长与人射光波长不同的Raman散射是光与分子振动交换能量的非弹性散射。而Brillouin散射是由于热声波引起的非弹性散射。对多原子分子或基团，荧光是高能电子激发态跃迁到电子基态中的各振动转动态产生的电子振动跃迁而形成的宽带发射谱。所以在共振光散射测定中，荧光将产生干扰。对于人射光频率和发射光频率仅有微小差别的准弹性散射，是由于散射质点不停的作Brown运动所引起的多普勒效应使散射光频率以人射光频率为中心而展宽。即动态光散射2。1.1.2 共振光的散射当Rayleigh散射的波长位于或接近于分子的吸收带时，其散射程度将不再遵守Rayleigh散射定律。而且某些波长的散射程度急剧增强，这种现象称为共振Rayleigh散射(Resonance Rayleigh Scattering，RRS) 3。由于RRS具有Rayleigh散射和电子吸收光谱的双重特性，灵敏度与选择性都有所提高，在很大程度上弥补了Rayleigh散射信号水平低的缺陷，可以用于稀溶液中的分子研究4。由于共振光散射理论主要是从共振Rayleigh散射增强的角度出发的，有时也称共振光散射为共振Rayleigh散射。1.2 共振光散射技术的实验方法及分析定量依据在普通的荧光分光光度计上选择合适的激发和发射通带宽度，采用相等的激发和发射波长同时扫描激发和发射单色器所得的同步光谱（即），即为散射粒子的共振光散射光谱2, 5, 6, 7。由于共振光散射光谱属于同步光谱，而散射光是源于等波长人射光激发散射粒子时产生的，因此散射粒子实际上是能发射出与激发光波长相等的新发光体，故而共振光散射信号属于同步发光5-7。根据同步发光方程式中是在给定激发光波长处的激发函数，是在对应 的发射光波长处的发射函数,K是与仪器条件常数有关的常数，b是液池厚度。当时，即得共振光散射强度5-7：即在仪器条件一定时，共振光散射强度与散射粒子的浓度成正比，据此可以用于散射粒子的定量测定5-7。1.3 共振光散射技术在核酸分析中的应用 散射光在常规光分析中通常是作为一种干扰而被消除。1993 年, Pasternack 等用普通荧光光度计建立了共振光散射技术8, 并将其用于生物大分子的识别、 组装和聚集研究。1995年，刘绍璞等人发现离子缔合物水溶液有二级散射(SOS)和反二级散射(ASOS)现象9,10，以此建立的分析方法，使共振光散射技术的应用范围进一步扩大。近年来，共振光散射技术已被广泛用于生物大分子的测定。目前，用于核酸分析的共振光散射探针主要有有机染料试剂、表面活性剂、大分子散射试剂、金属离子及络合物等试剂。1.3.1 有机染料试剂在共振光散射分析测定核酸的技术中，常用一些染料分子作为RLS探针。它是基于染料在核酸等生物大分子上进行堆积，即生物大分子对染料起了富集作用，使其上染料浓度远大于溶液中游离的染料浓度，相当于聚集体的生成，使散射球体体积增大，所以尽管吸收谱图无变化，但却观测到强烈增强的RLS信号11。黄承志利用meso-4(对N-三甲基氨基)卟啉(TAPP)在pH=7.48条件下与核酸作用能产生增强的共振光散射信号，并在432 nm附近产生特征吸收峰，结果说明利用核酸对TAPP的共振光散射增强现象可以测得纳克级的核酸，测定检出限比荧光猝灭法低一个数量级12。醌亚胺类的染料如藏红T(ST) 13、中性红(NR) 14-17、亚甲基蓝(MB) 18,19可以在核酸分子表面进行长距离组装，能产生特征的共振光散射光谱。某些碱性三苯甲烷染料如乙基紫(EV) 20,21、结晶紫(CV) 21,22、甲基紫(MV) 21,23、和玫苯胺(RL) 24能与核酸结合而使 RLS急剧增强并产生新的RLS光谱，用于核酸的分析测定，具有较高的灵敏度。酚藏花红(PS)与核酸作用能导致体系折光指数发生变化，使 RLS强度急剧增加23；耐尔蓝(NB)的硫酸盐25,26用于小牛胸腺DNA(ctDNA)的测定，灵敏度很高，检出限最低可达0.4gmL-1；陈小明等还进行了灿烂甲酚蓝(BCB) 27和副品红(PRL) 28共振散射法测定DNA的研究。近来关于罗丹明染料如罗丹明B(RB) 29、罗丹明B(BRB) 30、罗丹明6G(RH6G) 31与核酸作用的共振光散射光谱的研究也有报道。另外，许金钩等人将合成的四氨基铝酞菁(TAAlPc)用于测定纳克级核酸32，并将其用于金黄色葡萄球菌DNA的测定，所得结果与紫外吸收法一致。Table 1 Resonance light scattering of reaction between DNA and organic dyes (1)染料试剂DNApH值最大波长/nm线性范围/g mL-1文献TAPPCtDNA7.48432.00.060.3612STCtDNA5.67.4328.002.513NRCtDNA2.3330.00.0485.2514NRCtDNA7.67.8535.0-15NRCtDNA7.67.8535.001.216NRCtDNA5.07.0335.000.617MBCtDNA6.878.74355.001.418MBDNA5.57.5350.00.21.419EVCtDNA5.010.0510.000.520EVCtDNA6.38.4505.002.021CVFsDNA6.78.0495.002.021CVDNA9.210.5512.000.922MVFsDNA6.78.0520.002.021MVCtDNA1.0344.00.10.723RLDNA11.0485.001.024PSCtDNA7.28.0340.003.525NBCtDNA7.28.0293.801.025、26NBSCtDNA7.27.5293.400.826BCBDNA10.811.5347.00.08127PRLDNA0.51.5335.00.11528RBCtDNA1.0378.00.11629BRBCtDNA1.1380.00.019.630Rh6GCtDNA1.1400.00.0537.031TAAlPcCtDNA6.0400.000.2532盛立娇等基于DNA 在pH为3.514.49的介质中对有机染料次甲基蓝(MB)的共振光散射的增强效应，提出了一种测定DNA的共振光散射法33，并对介质酸度、离子强度、DNA热变性、共存物质干扰等实验条件进行了优化。1.3.2表面活性剂1.3.2.1单纯的表面活性剂刘绍璞等研究了5种阳离子表面活性剂与核酸反应的共振光散射光谱34。结果表明，在近中性介质中阳离子表面活性剂(CS)与核酸反应使其RLS急剧增强，而且5种CS与核酸具有相同的反应条件和光谱曲线，文中还对五种阳离子表面活性剂与核酸的反应机理、核酸构象对RLS的影响等进行了讨论。 陈展光等直接将两性离子表面活性剂用于DNA的共振光散射测定35。在pH=9.3的缓冲溶液中，DNA与十二烷基甲基甜菜碱（BS-12）在388 nm处有共振光散射增强，其强度与核酸的浓度呈线性关系，据此建立了一种测定DNA的共振光散射法。该方法具有操作简单、线性范围宽、检出限低的特点。fsDNA与ctDNA的线性范围分别为0.2512.0 gmL-1和0.2511.0 gmL-1，检测限分别为0.15和0.16 gmL-1。该法用于混合样品中DNA的测定，结果满意。1.3.2.1表面活性剂+有机染料试剂在一些表面活性剂存在下DNA与染料产生共振光散射光谱的增强作用的研究也时有报道。如碱性三苯甲烷染料亮绿(BG)和孔雀石绿(MG)与核酸结合后的RLS强度变化不明显23。而在溴代十六烷基甲基铵(CTMAB)的存在下，BG 36,37和MG 38,39与DNA体系的共振光散射大大增强。其它的研究还有十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)使得阴离子染料间苯二酚黄(RY) 40与DNA结合、溴代十六烷基吡啶(CPB)存在下间甲酚紫(CP) 41与DNA发生作用，都使得体系的共振光散射大大增强，即表面活性剂对DNA与染料作用产生的共振光散射具有敏化作用。Table 2 Resonance light scattering of reaction between DNA and organic dyes (2)染料试剂DNApH值最大波长/nm线性范围/g mL-1文献CTMAB-BGctDNA10.411.8466.801.236CTMAB-BGctDNA7.58470.001.237CTMAB-MGctDNA2.21337.602.038CTMAB-MGctDNA9.7482.00.02160.06439CTAB-RYfsDNA3.15340.004.040CPB-CPctDNA4.5550.00.11041夏忠瑜等研究了在阳离子表面活性剂溴化十六烷基三甲铵(CTMAB)存在下，阴离子染料固红VR盐(FVR)和鱼精脱氧核糖核酸(fsDNA)作用的共振光散射(RLS)光谱特性、影响因素和最佳反应条件42。在pH=5.72和离子强度低于0.0l molL-1的条件下，fsDNA和CTMAB对FVR的共振光散射光谱有协同增强作用，产生最大散射波长为361 nm的共振光散射增强(RISE)信号。在优化实验条件下，测定fsDNA的线性范围为 0.0l2.0 mgL-1，检出限可达2.5 gL-1。方法能用于合成样中DNA的测定。在pH=9.90的Tris-HCI缓冲溶液中，阴离子染料二甲苯兰FF(XCFF)对阳离子表面活性剂溴化十六烷基三甲基铵(CTMAB)与核酸(fsDNA，ctDNA、yRNA)的共振光散射光谱有协同增强作用43。杨孝容等利用共振光散射光谱法研究了维多利亚蓝B与小牛胸腺DNA作用的影响因素和最佳条件44。在室温，pH为5.26.2的(CH2)6N4-HCI的缓冲溶液和表面活性剂OP的条件下，维多利亚蓝B与小牛胸腺DNA作用对应有两个最大的共振光散射峰相应的波长在410 nm和572 nm附近当DNA的浓度在0050.8 mgL-1范围内共振光散射峰的增强与DNA的浓度成正比，检出限(3k)为20 gL-1。该方法用于合成样品中DNA的测定，相对标准偏差为1.42.9(n=10)，加标回收率为97l03。1.3.3 大分子散射试剂在强酸性介质中，核酸首先变性，然后单链核酸聚集为大粒子，粒子的大小与紫外可见光的波长相当，由动态激光散射仪测得在强酸性介质中粒子的水合半径与其浓度呈线性关系45。由大粒子产生的光散射强度在很宽的范围内与核酸的浓度成正比（见表2）,该方法具有灵敏度高、线性范围宽、操作简便、所用试剂易得的优点，应用前景广泛。Table 3 Resonance light scattering of RNA in acidic medium试剂DNA最大波长/nm线性范围/gmL-1文献H2SO4ctDNA310.00.0870.045HClctDNA310.00.06100.045HNO3ctDNA343.00.1100.045H3PO4ctDNA310.00.180.045HClO4ctDNA310.00.048.00.880.045HAcctDNA310.00.048.045硫酸鱼精蛋白是一种小分子蛋白，它能与核酸通过强静电力作用结合为大粒子的复合物，其散射光强度在pH为2.24.4的Britton-Robinson缓冲溶液中达到最大46。由此建立的核酸的大粒子散射分析方法的线性范围为0.0560 gmL-1；其检出限分别为12.5 gmL-1的小牛胸腺DNA、9.0 gmL-1的鱼精子DNA、18.0 gmL-1的酵母RNA。其优点是蛋白质、核苷酸和大部分金属离子都不干扰对核酸测定的结果。闫秋君等用核酸与聚阳离子聚甲基丙烯酰氧乙基苄基二甲基氯化铵(PMBDAC)的相互作用导致共振光散射增强的现象来测定核酸47。此方法的抗干扰能力较强，可允许大部分的常见金属离子、核苷酸、氨基酸、糖、蛋白质等干扰物质的存在。李艳坤在pH为2.214.35的Britton-Robinson(BR)缓冲溶液中，使DNA与蛋白质相互作用形成复合物，引起较DNA或蛋白质单独存在时的 RLS信号的强烈增强48。用于分析蛋白质与 DNA结合的相互作用。实验结果显示：DNA与蛋白质之间存在较强的静电相互作用。在最佳实验条件下，波长 315.0 nm处，RLS强度的增强与牛血清白蛋白(BSA) 在0.051.3 gmL-1呈良好的线性关系，检出限达到纳克级。1.3.4 金属离子及络合物近来也有关于金属离子及其络合物与核酸作用的共振光散射现象的研究。黄承志发现Co()/5-Cl-PADAB在核酸上的堆积对共振光散射增强现象，并将其用于核酸的高灵敏测定6。在pH=2.21的酸性介质中Al3+与DNA分子表面的磷酸根发生静电作用，产生增强的共振光散射49。与染料不同的是，金属离子没有生色基团，因而它们与核酸和蛋白质等生物大分子的作用受光吸收的影响小，主要体现出粒子大小对RLS信号的影响。周敏等研究了桑色素与Ce()反应形成的络合物与DNA作用的共振光散射(RLS)特征，发现小牛胸腺DNA(ctDNA)或鲱鱼精DNA(hsDNA)的加入都能使桑色素- Ce(IV)体系在320 nm处的共振光散射峰增强50。在最优条件下，RLS强度与ctDNA的浓度在025 gmL-1范围内呈良好的线性关系，检出限为0.3 gmL-1；但是RLS强度对hsDNA的浓度却没有线性响应。并且，由于RLS强度对hsDNA浓度的响应值大大低于同浓度的ctDNA，因此可用于hsDNA存在下对ctDNA的选择性测定。将该法用于4种合成样的测定，回收率在93.7108.4之间。黄剑平等研究了Ru(bpy)2(dppx)2+-sDs-DNA(bpy=2,2-联吡啶，dppx=7, 8-二甲基-吡啶并3, 2-a:2, 3-c吩嗪)体系的共振光散射光谱51。结果表明，在阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)预胶束聚集体存在下。Ru(bpy)2(dppx)2+-sDs体系具有很强的共振光散射，DNA的加人使其共振散射光猝灭。探讨了反应机理。基于DNA对Ru(bpy)2(dppx)2+-sDs体系共振光散射的猝灭作用，建立了共振光散射法测定DNA的新方法。1.3.5 药物由于体外与DNA作用的药物一定程度上在体内也能与DNA作用，即药物与DNA作用在体内与体外具有一致性52，因此在体外首先进行药物筛选很有意义。目前一般采用紫外分光光度法和荧光法研究药物与DNA的相互作用，应用共振光散射技术在体外研究药物与纯粹DNA的作用。药物对DNA的构象变化等对药物的活性筛选具有十分重要的意义，可以得到更多的信息。冯硕等研究了抗癌药物阿霉素与DNA 相互作用的吸收光谱，荧光光谱和共振光散射光谱发现阿霉素与DNA 相互作用产生强烈增强的共振光散射信号，共振光散射技术在研究 DNA 与阿霉素的相互作用时，其灵敏度远远高于吸收光谱和荧光光谱53。DNA与阿霉素作用在322 与564 nm 处产生两个共振散射峰，在弱酸性条件下(pH=5.72)，DNA的浓度在08.0 gmL-1范围内与散射强度呈良好的线性关系，对小牛胸腺DNA和鱼精子DNA的检出限分别为36.8和40 gmL-1。刘江涛等用共振Rayleigh散射(Resonance Rayleigh scattering，RRS)光谱结合吸收光谱和荧光光谱研究了盐酸平阳霉素(BleomycinA5，BLMA5)与核酸的相互作用54。在pH=2.2左右的酸性介质中，BLMA5能够与核酸结合形成复合物，引起RRS显著增强，并产生新的RRS光谱，具有特征吸收波长红移和分子吸收增色效应，能观察到BLMA5的荧光猝灭。不同核酸的RRS光谱特征略有差异，最大散射波长分别位于301 nm(ctDNA和sDNA)，370 nm(hsDNA)和310 nm(RNAtype和RNAtypeVI)，散射增强的程度各不相同，其中DNA的增强程度比RNA大。讨论了BLMA5和核酸反应的最佳反应条件及影响因素，并对BLMA5与核酸的结合模式、反应机理进行了讨论。建立了一种以BLMA5为探针用RRS法测定DNA的高灵敏度、简单、快捷的分析方法。1.4 共振光散射技术的展望共振光散射技术只需普通的荧光分光光度计，该方法操作简单。测定灵敏度很高，检测限可达纳克级，有着广泛的应用前景，为生化及临床分析样品的微量分析测定提供了一条新的分析途径。共振散射技术具有灵敏度高、操作简便的优点，可以考虑将它与其它分析方法联合使用55。例如，可以采用高效液相一共振散射联用技术。由于高效液相技术主要用来分离混合物，当用它来检测物质含量时，灵敏度较一般的分析仪器稍低，这就限制了其使用范围。采用高效液相一共振散射联用技术，用高效液相色谱将混合物分离后再用共振散射技术来同步分析检测物的含量，就弥补了高效液相色谱作为分析仪器的缺点，可进一步扩大其应用范围。共振光散射法已被用于分子聚集状态的研究，它可以为理解复合体系的化学活性、生物活性及药理活性与体系组分的分子聚集状态的关系提供一个检测和表征，使共振散射技术成为化学研究的一种新兴手段。随着越来越多的分析工作者介入，共振散射分析技术的应用研究也在不断深入，其应用于分析过程中所体现出来的优点推动了其在分析领域的扩展。共振散射技术已展示出广阔的应用前景，这种技术必将作为一种常规的分析手段而为广大的分析工作者所应用。参考文献1 李原芳,黄承志,胡小莉.共振光散射技术的原理及其在生化研究和分析中的应用J. 分析化学. 1998, (12):1508-1515.2 魏永巨.瑞利光散射及其在生物化学分析中的应用研究.北京大学博士论文, 1997.3 Stanton S G, Pecora R, Hudson B S. 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