09青翘石油醚部位抑菌成分的筛选(齐萌萌.doc

青翘石油醚部位抑菌成分的筛选学生：齐萌萌 指导老师：薛慧清摘要:目的 筛选青翘石油醚部位抑菌成分，为进一步从连翘中寻找高效低毒的抗菌新药和抗菌先导化合物奠定基础。方法 采用K-B纸片扩散法测定青翘石油醚部位中不同化学部位对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的敏感性。结果 青翘石油醚部位中不同化学部位对不同菌株表现了不同程度的抗菌作用。青翘石油醚部位中不同化学部位对不同菌株的抗菌作用：大肠杆菌金黄色葡萄球菌白色念珠菌。对于这三种细菌，抗菌活性部位都集中于FrA6-FrA10。结论 青翘石油醚部位中极性较大的成分具有较强的抗菌活性，是其发挥清热解毒功效的物质基础。关键词: 青翘；抗菌作用；活性部位Screening of Antibacterial Components from Petroleum Ether Extract of Unripen Fructus ForsythiaeStudent: Qi Meng-Meng Supervisor: Xue Hui-qingAbstract: Objective screening antibacterial components from the petroleum ether extract of Unripen Fructus Forsythiae, in order to lay foundation for further research on new drugs of high-performance and low toxicity. Methods Kirby-Bauer disc agar diffusion method was used to determine the sensitivity of different fractions from Unripen Fructus Forsythiaes Petroleum ether extract against Staphyloccocus aureus, E. coli and Candida albicans. Results Different fractions obtained from the Petroleum ether extract of Unripen Fructus Forsythiae have different antibacterial activities against different bacteria as following: E. coli Staphylococcus aureus Candida albicans. For this three bacteria, the antibacterial active fractions are concentrated in FrA6-FrA10 phases. Conclusion For the Petroleum ether extract of Unripen Fructus Forsythiae, larger polar components have strong erantibacterial activities.They are material bases of the traditional function clearing away heat and toxic material.Key words: Unripen Fructus Forsythiae; antibacterial activity; active fraction连翘为木犀科植物连翘 Foesythia suspensa ( Thumb.) Vahl 的干燥果实。秋季果实初熟尚带绿色时采收，除去杂质，蒸熟，晒干，习称“青翘” ；果实熟透时采收，晒干，除去杂质，习称“老翘”1。连翘是常用的清热解毒类中药，临床应用广泛，目前以连翘为原料的中成药制剂也很多，如银翘解毒片、双黄连注射液等。现代药理研究表明，连翘为广谱抗菌药，对多种革兰氏阳性菌及阴性菌均有抑制作用。据报道青翘中的主要有效成分连翘酯苷和连翘苷的含量以及抗菌活性均高于老翘2-4。但目前临床多习惯用老翘，对连翘的研究也多集中于对老翘的研究5-7，对青翘的研究较少，尤其是对青翘抗菌活性部位的研究尚未见报道。本试验旨在通过对青翘体外抗菌活性部位的筛选，为青翘抗菌活性成分的进一步筛选提供试验依据。1材料与方法1.1 材料与仪器青翘石油醚部位：08年5月菌种：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherchia coli)、白色念珠菌(Candida albicans)，均由山西省药品检验所提供。试剂：95%乙醇，石油醚，三氯甲烷，乙酸乙酯，甲醇等，均为分析纯；0.9%氯化钠注射液（自制）；营养琼脂培养基（杭州天和微生物试剂有限公司，批号：050106）；牛肉膏（北京市海淀区微生物培养基制品厂，批号：040820）；蛋白胨（北京奥特博星生物技术有限责任公司，批号：20070816）；庆大霉素细菌药敏试纸（杭州天和微生物试剂有限公司，批号：070517）。仪器：LR4001型旋转蒸发仪(德国Heidolph公司)；CA-111型冷却水循环系统（上海爱郎仪器有限公司）；SHB-88型水循环真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；DHP-9162型电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；DSX-280B型手提式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；BBS-DSC型洁净工作台(上海巴艾贝斯科技有限公司)；BS224S-L型电子分析天平（德国Sartorius公司）。1.2 分析方法1.2.1 青翘石油醚部位不同极性部位的提取分离 拌样 取青翘石油醚部位浸膏230g，用混合溶剂（氯仿、乙酸乙酯、石油醚）溶解，拌入228g硅胶粉末（200-300目），搅拌均匀，自然挥干。过滤 将拌硅胶样过两层纱布得到浅绿色松散均匀粉末状物。准备装柱 取柱层析硅胶（200-300目）1200g用石油醚混悬搅拌，排除气泡后装柱（1300*70mm）反复用石油醚过柱并拍打柱壁至均匀（柱高930mm）。湿法装柱 取拌硅胶样198g（含有样品99g）加入硅胶柱中，纯石油醚洗脱，保留体积3000毫升。收集浓缩洗脱液 收集洗脱液6瓶（3000ml一流份），第7瓶开始浓缩且编号。在色带下移较缓慢时可换溶剂的极性（从小到大）继续洗脱，最后用甲醇冲柱。TLC检识（紫外灯254nm下或5%硫酸乙醇溶液显色）且合并相同流分，减压浓缩得10个部分FrA1- FrA10.在分离FrA1时第一瓶洗脱液中出现了透明的晶体，编号为“一”，用乙醇洗涤后呈白色，装于瓶子中保存。1.2.2 药敏纸片的制备8将普通定性滤纸用打孔机打成若干圆形纸片，直径为6mm，置于干燥洁净的试管内，放入压力蒸汽灭菌器中经121、20min高压灭菌，干燥。分别取干燥后的十个部位以及正丁醇部位浸膏0.5mg、1.0mg、2.0mg，用合适的溶剂溶解，将滤纸片放入溶液中，反复吸取、晾干，直至将溶液吸干，备用。1.2.3 培养基的制备固体培养基：用天平准确称取36g营养琼脂， 加入蒸馏水1000ml，加热并不断搅拌，使琼脂完全溶解。然后放入压力蒸汽灭菌器中经121、20min高压灭菌，取出趁热倒入经过高压灭菌的培养皿中，厚度约35mm，冷却凝固后备用。液体培养基9：用天平准确称取牛肉膏0.3g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g，加入蒸馏水100ml，加热并不断搅拌，用1 %NaOH溶液调节PH7.27.4。然后放入压力蒸汽灭菌器中经121、20 min高压灭菌，分装于试管中，备用。1.2.4 菌悬液的制备 用接种环分别取各菌种一环，接种于液体培养基中，放入37培养箱中培养24h，用灭菌生理盐水分别稀释至110-3浓度，备用。1.2.5 药物抑菌作用测定采用K-B纸片扩散法10，用无菌移液管吸取稀释好的菌悬液0.1mL，置于培养基中央，用涂布棒涂布均匀。用无菌镊子夹取含药滤纸片贴在培养基表面，以含药量为10g的庆大霉素细菌药敏试纸为阳性对照。放入37培养箱中培养24h后，观察抑菌圈，并用十字交叉法测量抑菌圈直径。每种浓度对3种菌均做3组平行对照，结果取平均值。2 结果与分析2.1 青翘石油醚部位中不同化学部位对大肠杆菌的抗菌作用由表1和图1可知，除FrA3、FrA4部位外，其余各部位对大肠杆菌均有一定抑制作用。其活性比较，FrA10FrA7FrA8FrA9FrA6FrA5FrA2FrA1。并且FrA6、FrA7、FrA8、FrA9在样品量为1.0mg时抗菌活性最强，而FrA10、FrA6在样品量为2.0mg时抗菌活性最强。这与文献报道的连翘乙醇提取物的浓度与抑菌作用强弱之间并不成简单的正比关系11相一致，提示我们多种成分同时存在时可能仅存在“最适抑菌浓度”。表1 青翘石油醚部位中不同化学部位对大肠杆菌的抑菌圈直径(单位:mm)样品量FrA1FrA2FrA3FrA4FrA5庆大霉素0.5mg1.0mg2.0mg-6.7-8.38.5-10-10.533样品量FrA6FrA7FrA8FrA9FrA10庆大霉素0.5mg1.0mg2.0mg-1414.5813.813813.58812118101633注：“ ” 表示没有明显抑菌圈。纸片样品量0.5mg 纸片样品量1.0mg 纸片样品量2.0mg a32145a1234512345a纸片样品量0.5mg纸片样品量2.0mg纸片样品量1.0mga6678910678910a678910a图1 青翘石油醚部位中不同化学部位对大肠杆菌的抗菌作用（a. 庆大霉素; 1.FrA1; 2. FrA2; 3.FrA3; 4.FrA4 5. FrA5; 6. FrA6; 7. FrA7; 8.FrA8; 9.FrA9; 10.FrA10）2.2 青翘石油醚部位中不同化学部位的最强抑菌作用部位FrA10和正丁醇部位对大肠杆菌的抗菌作用比较 由表2和图2可见，青翘石油醚部位中FrA10的抑菌活性大于正丁醇部位的抑菌活性，说明FrA10的清热解毒作用强于正丁醇部位。表2青翘石油醚部位中最强抑菌化学部位与正丁醇比较对大肠杆菌的抑菌圈直径(单位:mm)样品量FrA10正丁醇庆大霉素0.5mg1.0mg2.0mg91013-6.57.333注：“ ” 表示没有明显抑菌圈。2.3 青翘石油醚部位中不同化学部位对金黄色葡萄球菌的抗菌作用 由表3和图3可看出，除FrA1、FrA3、FrA4部位外，其余各部位均对金黄色葡萄球菌均有抑制作用，其活性比较：FrA10FrA5FrA6FrA7FrA8FrA9FrA2。随着纸片样品量的增加，抗菌作用强弱表现不同。纸片样品量0.5mg 纸片样品量1.0mg 纸片样品量2.0mg10ba10ba10ba图2 青翘石油醚部位中最强抑菌化学部位与正丁醇比较对大肠杆菌的抑菌(a. 庆大霉素; b.正丁醇；10.FrA10)表3青翘石油醚部位中不同化学部位对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径(单位:mm)样品量FrA1FrA2FrA3FrA4FrA5庆大霉素0.5mg1.0mg2.0mg-8-121036样品量FrA6FrA7FrA8FrA9FrA10庆大霉素0.5mg1.0mg2.0mg810108910888-88815.51636注：“ ” 表示没有明显抑菌圈。纸片样品量2.0mg 纸片样品量1.0mg 纸片样品量0.5mg 122345a12345a12345a2.4 青翘石油醚部位中不同化学部位的最强抑菌作用部位FrA10和正丁醇部位对金黄色葡萄球菌的抗菌作用比较纸片样品量2.0mg 纸片样品量1.0mg 纸片样品量0.5mg 768910a678910a678910a图3 青翘石油醚部位中不同化学部位对金黄色葡萄球菌的抗菌作用（a. 庆大霉素; 1.FrA1; 2. FrA2; 3.FrA3; 4.FrA4 5. FrA5; 6. FrA6; 7. FrA7; 8.FrA8; 9.FrA9; 10.FrA10） 由表4和图4可见，青翘石油醚部位中FrA10的抑菌活性小于正丁醇部位的抑菌活性，说明FrA10的清热解毒作用弱于正丁醇部位。表4青翘石油醚部位中最强抑菌化学部位与正丁醇比较对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径(单位:mm)样品量FrA10正丁醇庆大霉素0.5mg1.0mg2.0mg1213.5131015.51836注：“ ” 表示没有明显抑菌圈。纸片样品量2.0mg 纸片样品量1.0mg 纸片样品量0.5mg 10ab10ab10ba图4 青翘石油醚部位中最强抑菌化学部位与正丁醇比较对金黄色葡萄球菌的抑菌（a. 庆大霉素; b.正丁醇；10.FrA10）2.5 青翘石油醚部位中不同化学部位对白色念珠菌的抗菌作用由表5和图5可见，FrA1-FrA5各部位对白色念珠菌没有抑制作用。FrA6-FrA10各部位对白色念珠菌的抑制作用较弱且各浓度抗菌作用相差不大，在纸片样品量不同时，均有显示出略强抗菌活性的现象。与青翘不同化学部位对大肠杆菌的抗菌作用一样，说明了浓度与抑菌作用强弱之间并不成简单的正比关系。表5青翘石油醚部位中不同化学部位对白色念珠菌的抑菌圈直径(单位:mm)样品量FrA1FrA2FrA3FrA4FrA5庆大霉素0.5mg1.0mg2.0mg-30样品量FrA6FrA7FrA8FrA9FrA10庆大霉素0.5mg1.0mg2.0mg788.578.57.57779-9.51099.530注：“ ” 表示没有明显抑菌圈。纸片样品量2.0mg纸片样品量1.0mg纸片样品量0.5mg123a45a12345a12345 纸片样品量2.0mg纸片样品量0.5mg纸片样品量1.0mg6789a106789a10678910a 图5 青翘石油醚部位中不同化学部位对白色念珠菌的抗菌作用（a. 庆大霉素; 1.FrA1; 2. FrA2; 3.FrA3; 4.FrA4 5. FrA5; 6. FrA6; 7. FrA7; 8.FrA8; 9.FrA9; 10.FrA10）2.6 青翘石油醚部位中不同化学部位的最强抑菌作用部位FrA10和正丁醇部位对白色念珠菌的抗菌作用比较 由表6和图6可见，青翘石油醚部位中FrA10的抑菌活性与正丁醇部位的抑菌活性相差不多，而且抑菌作用很弱。表6青翘石油醚部位中最强抑菌化学部位与正丁醇比较对白色念珠菌的抑菌圈直径(单位:mm)样品量FrA10正丁醇庆大霉素0.5mg1.0mg2.0mg99.58.57.58.3930注：“ ” 表示没有明显抑菌圈。纸片样品量2.0mg纸片样品量0.5mg纸片样品量1.0mg10abba1010ab图6 青翘石油醚部位中最强抑菌化学部位与正丁醇比较对白色念珠菌的抑菌（a.庆大霉素; b.正丁醇；10.FrA10）3 讨论本试验表明：青翘石油醚部位中不同化学部位对不同菌株表现了不同程度的抗菌作用。青翘石油醚部位提取物对不同菌株的抗菌作用：大肠杆菌金黄色葡萄球菌白色念珠菌。大肠杆菌是目前引起肠胃不适、腹泻的常见菌，这与中医药认为连翘具有清热解毒功效的临床应用基本吻合，且金黄色葡萄球菌是目前引起上呼吸道感染的常见菌，这与中医药认为连翘具有清热解毒功效，以及连翘治疗呼吸道感染的临床应用基本吻合。对于这三种细菌，抗菌活性部位集中于FrA6-FrA10部位；且对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌作用强于白色念珠菌。这说明青翘石油醚部位中极性较大的成分具有较强的抗菌活性，是其发挥清热解毒功效的物质基础。本试验在研究青翘石油醚部位的提取物对大肠杆菌的抗菌作用过程中，发现FrA7、FrA8、FrA9部位的提取物浓度与抗菌作用强弱之间不成正比关系, 查阅相关资料11，推测其原因可能是青翘提取物中的某些极性小的成分提供了菌体生长所需的“营养物质”，或是这些极性小的成分刺激了菌体的生长。由于中药成分的复杂性和各种成分性质的差异性，使药物作用过程和机理更加复杂，因此，以往参照抗生素求最小抑菌浓度（MIC）的方法很难准确地反映青翘的抗菌活性，应该寻求它的“最适抑菌浓度”。 此外，FrA10的抗菌活性不及正丁醇部位的抗菌活性，可能是由于正丁醇中抗菌活性成分的相对含量大于FrA10，或者是由于正丁醇中的多种成分发挥了多重作用，使得抗菌活性升高，也或者是青翘中主要抗菌活性部位是正丁醇部位。所以，我们有必要将青翘中的抗菌活性部位或抗菌活性成分分离出来，使其更好的发挥抗菌作用。现代研究表明，尽管清热药清泻里热功效与该类药抗病原体、抗毒素、抗炎、解热、调节机体免疫功能及抗肿瘤等药理作用有关。但是，在没有抗菌药物的古代，临床上一些感染性疾病的最终治愈还是依赖清热药的抗病原体作用，因此抗菌是这类药物的主要药理作用12。本试验反映了青翘石油醚部位的体外抗菌活性，青翘在机体