核酸分离纯化及电泳.doc

基因工程原理Introduction to genetic engineerins一、基因工程的定义：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。二、基因工程诞生的理论基础1 . DNA是遗传物质1944年 Avery，确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。1952年Alfred Hershy和Marsha Chase进一步证明遗传物质是DNA。2. DNA双螺旋结构1953年James D. Watson和Francis H. C. Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。3、中心法则与遗传密码1957年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则” 1964年Marshall Nirenberg和Gobind Khorana等终于破译了64个遗传密码在遗传学上，把遗传信息的流动方向叫做信息流。信息流的方向可以用科学家克里克提出的“中心法则”来表示。从“中心法则”可以看出，遗传信息的一般流动方向（图中红线所示）是：遗传信息可以从DNA流向DNA，即完成DNA的自我复制过程，也可以从DNA流向RNA，进而流向蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译过程 受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。 三、基因工程诞生的技术突破1. 限制性内切酶（restriction enzymes）1970年H.O. Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶。2. DNA连接酶（ligase）1967年5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。3. 载体（vector）1972年前后使用小分子量的细菌质粒和l噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。4. 感受态体系1970年M. Mandel和A. Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S. Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA。5. 琼脂糖凝胶电泳1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开。6. DNA测序技术1975年F. Sanger、A. Maxam和W. Gilbert发明了DNA快速测序技术。四、基因工程的特征1. 跨物种性外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。2. 无性扩增外源DNA在寄主细胞内可大量扩增，和高水平表达。五、基因工程的主要操作内容1. 目的基因的获取从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。2. 重组体的制备将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。3.重组体的转化将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。4.克隆鉴定挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。5.目的基因表达使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。第一节 分子生物学实验室常用设备温度控制系统n 冰箱：4 0C、-20 0C、-70 0Cn 恒温培养箱：隔水式、电热式n 鼓风干燥箱n 恒温水浴n 低温循环水浴n 微量加热器n 恒温空气摇床n PCR热循环仪n 制冰机n 冷库n 高压蒸汽灭菌器电泳设备u 琼脂糖凝胶电泳系统u 垂直板凝胶电泳系统u 转移电泳系统u 紫外分析仪u 凝胶成像系统离心设备u 台式高速冷冻离心机u 高速冷冻离心机u 大容量离心机u 超速离心机分光光度计722S、7200可见分光光度计紫外可见分光光度计其它n PH计n 电子天平n 旋涡振荡器n 磁力搅拌器n 超声波破碎仪n 超净工作台n 纯水器第一章 基因工程的主要技术原理第一节 DNA的提取与纯化由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，DNA的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。一、质粒DNA的提取（一）、质粒载体概念 细菌质粒是独立于宿主基因组复制、编码抗生素抗性基因的小型环状DNA分子、运载克隆DNA的常用载体。 质粒特点：染色体外的小型环状分子，大小约为2200kb，通常以多拷贝(可多达几百个)形式存在于宿主细胞中。质粒含有复制起点(ori)用以保证质粒的自主复制正常复制依赖宿主细胞中的聚合酶及其他成分。质粒一般仅携有几个基因抗生素物质的抗性基因。最常见的抗性基因是amp+基因，编码可以降解青霉素类抗生素如氨苄青霉素的内酰胺酶。另一种常见抗性基因是tetA基因，编码一种可以从细胞内将四环素类抗生素排出的跨膜蛋白。pMD-18 T Vector pGEMT(二)、质粒DNA的制备小量法：碱裂解法（11分30秒）大量法：CsCl密度梯度离心法（1分30秒）试剂盒：由于质粒远远小于大肠杆菌染色体DNA，可以用物理化学方法将它们相分离，例如碱裂解法。1 .碱抽提法提取质粒DNA（1）原理 闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；（2） 所用的试剂作用 溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的b-1，4糖苷键。 在碱性条件（pH8）下有活性。 葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。EDTAMg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。NaOH-SDSNaOH：强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。 SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。 NaAc-HAc缓冲液冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。 用来中和NaOH变性液，使DNA复性。高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。 乙醇用于沉淀DNA。DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。 RNase A降解RNA渣滓。 以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。 TE缓冲液DNA保存液。 由Tris-HCl和EDTA配制。 Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲业），有利于以后操作； EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。 酚-氯仿蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。 但苯酚会残留在DNA溶液中。 （现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。（3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤 第一步：溶菌使用“溶液”溶解细菌细胞壁。Solution I 的配制：50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl(pH8.0)， 10mM EDTA， 4-5mg/ml溶菌酶， RNase A第二步：破膜，蛋白质和DNA变性溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。Solution II 的配制：0.2N NaOH，1.0%SDS第三步：中和溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。Solution III的配制：3M 醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）第四步：离心除去沉淀上清液中含有闭合质粒DNA。第五步：纯化DNA上清液过柱或酚-氯仿抽提。第六步：沉淀DNA0.6倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇。. 小量法：碱裂解法（11分30秒）携有目的质粒的大肠杆菌菌株数毫升液体培养基（LB）增殖至稳定期(过夜培养)离心 菌体沉淀小量制备法提取质粒. 氯化铯梯度（1分30秒） 制备大量的质粒可作为常用克隆载体贮备，或用作大量酶解反应的底物。此时CsCl密度梯度离心可被用来作为最终纯化步骤。该步骤虽然有点费力，但却是获得极纯的超螺旋质粒DNA的最佳方法。. 试剂盒（11分30秒） QIAGEN 等试剂盒 .一步法提取质粒DNA（16分20秒）2. 影响质粒DNA产量的因素最重要的是：菌株的遗传背景，质粒自身的拷贝数。（1）受体菌株一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株。如DH5a、JM109、XL1-Blue等。endA基因编码核酸内切酶，在Mg2+的存在下可将双链DNA消化成7bp的寡核苷酸片断。（2）质粒拷贝数这是直接决定DNA产量的重要因素之一。质粒本身的性质所决定。（3）质粒大小分子量大的质粒，拷贝数少。二、基因组或其他DNA的提取1.细菌基因组DNA的制备一般过程及原理（1）细胞裂解10%SDS和蛋白酶K。37 oC温育。不用NaOH !（2）DNA纯化CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)除去多糖，酚-氯仿-异戊醇除去蛋白。（3）沉淀DNA0.6倍体积的异丙醇。2. 哺乳动物细胞基因组DNA的抽提一般过程及原理：（1）组织粉碎动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末。 组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。（2）细胞裂解0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50 oC温育。SDS是离子型去垢剂（detergent），可以使细胞膜崩解。（3）纯化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。（4）沉淀DNA用2倍体积的无水乙醇（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀）（5）除去RNA污染用RNase。三、DNA的定量和纯度测定1. 紫外光谱法原理：DNA（或 RNA）在260nm波长处有特异的紫外吸收峰。蛋白质在280nm处有吸收峰用微量比色杯（10ml）在紫外分光光度计直接测定。2. 琼脂糖凝胶电泳估计原理：溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能发 红色荧光。与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量。四、DNA分子量的估计一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得知。DNA分子量Marker有许多公司的商品，使用非常方便。如lDNA的Hind酶切物等。第二节 DNA的凝胶电泳一、电泳的基本原理1. 带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。 2. 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。 3. 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。 4. 摩擦系数主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关。5. 如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同（电泳液和凝胶）： 分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状。 形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大，移动越慢。相同分子量的DNA:环状卷曲超螺旋迁移最快， 线性分子次之， 伸展开环状最慢。 二 、琼脂糖凝胶电泳1. 琼脂糖是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。2. 琼脂糖凝胶琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨”。琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。浓度高 空隙小3.琼脂糖凝胶的分辨力空隙大小决定其分辨分子大小的能力。空隙小，分辨率高： 小分子较易通过，而大分子难通过； 空隙大，分辨率低： 大小分子几乎以同等速率通过。琼脂糖的浓度（%）分离DNA的片断大小（bp）0.3 0.7 1.4500001000 200001000 6000300三 、聚丙烯酰胺凝胶电泳优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。琼脂糖凝胶电泳：100050000bp 聚丙烯酰胺凝胶电泳：11000bp聚丙烯酰胺凝胶浓度（%）分离DNA片断大小（bp）4.0 10.0 20.01000100 50025 501四、凝胶染色1. 染料溴化乙锭。Ethidium bromide （EB）2. 原理EB是扁平分子，能插入DNA碱基之间，但不与琼脂糖结合。 EB在300nm紫外光照射下能发红色荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。 荧光强度与DNA含量及大小成正比。UVP全自动凝胶成像分析系统OMEGA8-LOGO全自动凝胶成像分析系统第二节 DNA克隆概述一、DNA克隆： 通过将生物体基因组DNA片段作为自主复制载体的一部分进行独立复制的方式，使对该片段的分离及操作简单化。 背景：长期以来，由于生物体内某些蛋白质或其他组分的含量稀少难以大量纯化，造成对这些物质的详尽分子分析极其困难或者几乎不可能。 一种途径是直接分离负责某一蛋白质表达的或某一产物形成的基因。然而每个生物体的基因组都很庞大、复杂，且任一目的基因序列通常在单个细胞中只出现一到两次，因此标准的化学或生化方法都不能被用来分离基因组中的特定区域以对其进行研究，尤其是当目的DNA序列与所有其他序列具有化学相同性时更加困难。 解决这一难题的方法是将基因组中携有该基因或其他相关序列的较小片段连接到一段可以自主复制的DNA即载体上，形成通常可以在另一宿主中进行复制的重组DNA，这种复制是独立于原初基因组的。带有重组DNA的宿主细胞的增殖构成了一群具有遗传一致性的个体，或称为单克隆。这一系列操作过程就被称作DNA克隆。在进行DNA克隆中，通常将以下操作、制作或生产归为遗传工程范畴：u DNA序列分析，以及由此派生的蛋白质序列分析u 对基因启动子及其他调控序列的分离与分析u 通过大量正常和突变形式的产物研究来了解这些蛋白质酶RNA的功 能u 突变的鉴定，例如由于基因缺陷导致形成的疾病u 生物技术，如蛋白质及其他重要生物功能的分子如人胰岛素和生长素的大规模工业化生产u 工程动物、工程植物以及基因治疗u 改变了特性的工程蛋白质 二、宿主和载体 基因克隆过程中的大多数常规操作中都使用大肠杆菌作为宿主细胞。 质粒和噬菌体可作为大肠杆菌的克隆载体。质粒、病毒及整个染色体的载体一直被用作外源基因导入其他原核及真核生物体内的工具。 1.环状质粒： 染色体外(与染色体相独立的)2. 许多噬菌体(侵染细菌的病毒)：v 噬菌体：可用来克隆较大的DNA片段，v 噬菌体M13：可以使克隆DNA以单链形式被提取出来。v T载体：v 黏粒:质粒入噬菌体杂合体。3.酵母: 酵母质粒载体(酵母游离型质粒，yeast episomal plasmid)，对于植物一种细菌质粒(根癌农杆菌Ti质粒，Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid)4.病毒: 其他真核细胞，常用那些能自然侵染目标物种的病毒作为载体将其DNA维持在染色体外，或者是整合到宿主基因组(例如SV40、杆状病毒、反转录病毒)。 三、亚克隆 是克隆实验中最简单的一种，即将已克隆的DNA片段从一载体向另一载体的转移，这一过程被称为亚克隆。 亚克隆可用来对较大的克隆片段上较短区段进行仔细研究，或是将基因转移到能在特定物种中表达的另一载体上。就大肠杆菌的质粒载体来说，最常见的亚克隆程序可分为以下步骤：含有目标克隆序列的质粒DNA的提取用限制性内切核酸酶将质粒酶切成不连续的片段经琼脂糖凝胶电泳分离片段纯化目标片段将目标片段连接在一新质粒载体上，形成新的重组分子将连接好的质粒转入某一大肠杆菌菌株(转化，transformation)转化细菌的筛选重组质粒的分析四、DNA文库由基因组或cDNA的一套随机克隆片段构成，其中每个片段连在一个单独的载体分子上，常用来分离未知基因。 基因组文库是用基因组DNA的随机片段制备成的。缺点：用基因组文库来克隆某一基因是一种效率极低的方法，特别是对于庞大的真核生物基因组。用于鉴定未知基因的克隆实验的DNA有两个主要来源： 目的物种的基因组DNA。 用来自表达目的基因细胞或组织的mRNA作为来源构建成的文库即cDNA文库。经反转录将mRNA合成cDNA(DNA拷贝)后，插入载体构建成cDNA文库。五、筛选文库1、 通常是用一段与目的基因序列的某一区段互补或部分互补的放射性或荧光标记的DNA探针，通过杂交来检测出该基因。若基因的蛋白产物可获得，则探针可以是从该蛋白产物序列推测出的一段寡核苷酸，或者探针也可以来自另一物种中的某一相关基因。制备探针越来越常用的一种方法是聚合酶链反应PCR。2. 另一筛选方法是基于文库中被克隆的编码区表达后，对其蛋白产物进行活性鉴定，或是用特异抗体对其进行鉴定。六、克隆分析含有目的基因的克隆被确定，通过限制性酶切图谱即用限制性酶切来分析DNA片段，来对其克隆的片段的结构进行更进一步的研究，以至最终对全长片段进行测序。随后可通过将所得全长序列与数据库中其他已知序列进行比较分析，确定出该蛋白产物的完整序列。在体外进行DNA克隆与分析要用到许多酶，其中常用酶的特性特列于表G11中，详细描叙其应用的章节也已列于其后。 酶用途碱性磷酸酶从双链或单链DNA，或RNA的5端移去磷酸基。DNA连接酶(来自噬菌体T4由ATP水解提供能量，将dsDNA的戊糖磷酸骨架的5磷酸与3羟基相结合。待连接的DNA末端必须是相匹配的，即平端与平端，或为互补的黏性末端。DNA聚合酶I由含游离3羟基的引物起始，沿5至3的方向合成与DNA模板互补的DNA链。Klenow片段是DNA聚合酶I的缺失5至3外切核酸酶活性的截短部分。外切核酸酶III外切核酸酶从线性DNA的末端依次切除核苷酸。外切核酸酶只从dsDNA的3端切割。绿豆核酸酶降解单链核酸，留下完整的双螺旋区段。核酸酶S1类似绿豆核酸酶，并且能够降解对应于互补链缺刻对面的单链。多核苷酸激酶一个依赖ATP的反应，向双链或单链DNARNA的5-羟基末端添加磷酸基。若使用-32p ATP，则可将DNA标记上放射性同位素。限制酶在识别序列处(通常对称)切割dsDNA的双链。水解戊糖磷酸骨架，使其一端为5-磷酸基而另一端为3羟基，形成平端或“黏”末端(5或3凸端)反转录酶依赖RNA的DNA聚合酶。由含有游离3羟基的引物起始，沿5至3方向合成与RNA模板互补的DNA链，需要dNTP。RNase A只降解RNA，而不降解DNA的核酸酶RNase H降解RNA-DNA异源双链中的RNA链的核酸酶。T7，T3和SP6 RNA聚合酶分别由相应的噬菌体编码的专一性RNA聚合酶。每种酶只能识别自身的噬菌体DNA的启动子，特异地转录各自启动子下游DNA序列。Taq DNA聚合酶来源于嗜热细菌(Thermusaquatzcus)的DNA聚合酶。最适温度为72，在90以上仍相当稳定。用于PCR。末端转移酶可将核苷酸加到线性单链或双链DNA或RNA的3端。如只用GTP，则仅加上多个G。工具酶聚合酶名 称活 性主 要 用 途DNA 聚合酶I(全酶）5-3DNA聚合酶活性3-5外切酶5-3外切酶切口平移法标记3末端标记Klenow片段5-3DNA聚合酶活性3-5外切酶末端补平、末端标记cDNA第二链的合成T4噬菌体DNA 聚合酶外切核酸酶活性比Klenow片段活性高200倍体外诱变T7噬菌体DNA 聚合酶5-3DNA聚合酶活性3-5外切酶热稳定DNA依赖性的DNA聚合酶耐热PCR反转录酶以RNA为模板合成DNAcDNA的合成末端转移酶在2价阳离子存在时催化dNTP加于DNA分子的3羟基端cDNA末端加同聚尾末端标记依赖于DNA的RNA 聚合酶以DNA为模板合成RNA合成单链RNA做探针分子克隆