壳聚糖亲水性改性并应用于护肤营养素胶原蛋白缓释胶囊的制备.doc

壳聚糖亲水性改性并应用于护肤营养素胶原蛋白缓释胶囊的制备目录摘要IAbstractII 1.前言11.1壳聚糖的简介11.2壳聚糖的性质及结构11.3壳聚糖在化妆品中的应用21.3.1护肤用品21.3.2护发用品41.3.3美容化妆品41.3.4其他洗涤用品41.4壳聚糖的改性及其应用41.4.1壳聚糖羧基化反应 51.4.2壳聚糖酰化反应61.4.3壳聚糖烷基化反应61.4.3.1与卤代烷发生烷基化反应61.4.3.1.1 O 位烷基化71.4.3.1.2 N 位烷基化71.4.3.1.3 O,N位烷基化81.4.3.2与长链脂肪酰反应81.4.3.3与高级脂肪醛反应81.4.3.4与环氧衍生物反应81.4.4壳聚糖酯化反应81.5胶原蛋白的简介91.6胶原蛋白对皮肤的作用101.7胶原蛋白在化妆品中的应用111.7.1美容品111.7.2护肤品111.8胶原蛋白/壳聚糖胶囊111.9本课题研究的内容及其意义122.实验部分132.1实验仪器及药品132.1.1实验仪器132.1.2实验药品132.2 实验流程142.2.1壳聚糖硫酸酯的制备142.2.1.1合成方式142.2.1.2壳聚糖乙酸溶液的制备152.2.1.3硫酸酯化体系的选择152.2.1.4壳聚糖硫酸酯化162.2.1.5壳聚糖硫酸酯粗品后处理162.2.2壳聚糖硫酸酯的性能检测172.2.2.1红外光谱测定172.2.2.2酯化度测定172.2.2.3壳聚糖硫酸酯和壳聚糖的吸湿与保湿能力的测定172.2.3胶原蛋白/壳聚糖微球的制备182.2.3.1交联剂的选择182.2.3.2合成原理182.2.3.3合成方法192.2.3.4胶原蛋白/壳聚糖微球粗品的后处理192.2.4胶原蛋白/壳聚糖微球的性能检测192.2.4.1红外光谱测定192.2.4.2粒径分布与观察192.2.4.3胶原蛋白标准曲线的测定192.2.4.4体外释放203.结果与讨论213.1壳聚糖硫酸酯制备方法的确定213.2壳聚糖硫酸酯的红外分析213.3影响壳聚糖硫酸酯酯化度的因素233.3.1反应温度的影响233.3.2反应时间的影响233.3.3酯化基加入量的影响243.4壳聚糖硫酸酯和壳聚糖吸湿与保湿能力测试253.4.1吸湿性能253.4.2保湿性能263.5胶原蛋白/壳聚糖微球的红外分析263.6胶原蛋白/壳聚糖微球的粒径分布273.7胶原蛋白的紫外吸收光谱283.8胶原蛋白/壳聚糖微胶囊的体外释放及影响因素294.结论30参考文献31致谢34壳聚糖亲水性改性并应用于护肤营养素胶原蛋白缓释胶囊的制备沈玉荧摘要本文用浓H2SO4/DMF作为硫酸酯化体系，对壳聚糖进行硫酸酯化改性，以提高其吸水和保水能力。对壳聚糖硫酸酯化的反应温度、反应时间、物料比等影响因素进行了探讨，最佳反应条件为：600C, 3h，n（浓硫酸）：n(壳聚糖可反应基团) =6:1。对壳聚糖和壳聚糖硫酸酯的吸湿和保湿性进行测定，对壳聚糖硫酸酯的酯化度进行测定。用乳化交联法，以环氧氯丙烷为交联剂，以壳聚糖为载体，以胶原蛋白为模型药物，制备了胶原蛋白/壳聚糖微胶囊。经过体外释放模拟实验表明胶囊具有缓释效果，通过红外光谱表征胶原蛋白附在壳聚糖上。关键词：壳聚糖改性,硫酸酯化,保水性,胶原蛋白IHydrophilic modification of chitosan and collagen skin care nutrients preparation of sustained-release capsulesShen yuyingAbstractThis article uses concentrated sulfuric acid/ formamide as sulfonated system，sulfatedChitosan and improve its absorption efficiency and moisturizing efficiency.Various conditions were examined including the reaction temperature ,the reaction time and the amounts of initiator; optimum conditions：60,3h,n(H2SO4):n(Reactive group)=6:1. Determined the absorption efficiency , moisturizing efficiency of chitosan and sulfated chitosan; Determines the degree of esterification of sulfated chitosan. Based emulsifying , chemical cross-linking, uses epichlorohydrin as crosslinker, chitosan as polymer carrier , collagen as a model drug to make collagen/chitosan microcapsules containing drugs. Through simulation experiments in vitro release, show that the sustained release capsule. Characterization by IR show that collagen is attached to the chitosan .Keyword : modified chitosan, Sulfation , moisturizing function , Collagen II1. 前言1.1壳聚糖的简介地球上存在的天然有机化合物中，数量最大的是纤维素，其次就是甲壳素，前者主是由植物合成，后者主要由动物生成。它也是地球上除蛋白质外数量最大的含氮天然有机化合物。壳聚糖是甲壳素的部分脱乙酰基化产物，是自然界存在的唯一碱性多糖，它具有良好的生物相容性、生物降解性、几乎无过敏作用，具有许多医学功能和药物作用等功能1。壳聚糖属于氨基多糖，学名为(1,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，分子式为（C8H13N05）n，单体之间以（1-4）糖苷键连接。壳聚糖有，3种晶型，其中-壳聚糖存在最丰富，也最稳定2。壳聚糖，又名壳多糖、聚氨基葡萄糖等，是甲壳素的脱乙酰化产物，两者单元结构为： 甲壳素 壳聚糖1811年，法国科学家H.Braconnot从霉菌中首先发现了甲壳素，之后，1859年，Rouget在把甲壳素与氢氧化钾溶液中共煮时发现了壳聚糖。但由于当时科研水平较低，在近100多年的时间里对壳聚糖的研究时断时续。从1811年直到1910年的100年间，全世界仅有20篇关于壳聚糖论文的发表，开创性的工作大多是法国人做得。1934年在美国首次出现了关于制备壳聚糖的专利和制备壳聚糖膜、壳聚糖纤维的专利，并在1941年制备出了壳聚糖人造皮肤和手术缝合线,1936年和1943年，苏联人和日本人分别投入了甲壳素和壳聚糖的研究36。直到20世纪50年代以来，对甲壳素、壳聚糖的研究才变得活跃起来7。近 20 年来，随着壳聚糖多种生物活性的发现，全世界对该类产品的研究十分活跃，其应用领域也不断拓宽。从最初生产壳聚糖作为一般化工医药原材料，到目前研究开发高生物活性的低聚糖产品，现在已在化妆品、医学、药物学、生物工程、食品、 保健品、和农业等领域中得到了广泛的应用4-5。国际上十分重视壳聚糖这一资源的开发和利用，一场壳聚糖及其衍生物的开发热正在世界范围内兴起。有些研究者认为，甲壳素和壳聚糖将像塑料一样走进寻常百姓家，成为21世纪的支柱产业3。虽然我国从80年初甲壳素的开发利用引起了专家学者的重视,并且近些年来关于甲壳素和壳聚糖的各种应用已有不少报道6，但迄今为止，我国在这方面的研究仍很落后。1.2壳聚糖的性质及结构壳聚糖系白色或淡黄色片状固体，或青白色粉粒，略有珍珠光泽，半透明，干燥条件下可长期保存。因原料不同和制备方法不同，相对分子质量也从数十万至数百万不等。由于壳聚糖分子中含有大量的羟和氨基，分子之间存在很强的氢键作用，且分子量很高，结构紧密，使得它不溶于水和碱溶液，可溶于稀的盐酸、硝酸等无机酸和大多数有机酸，不溶于稀的硫酸、磷酸。溶于稀酸时呈粘稠状，于稀的硫酸。在酸性溶液中，分子中的-NH2与H+结合，生成带正电荷的聚电解质，这在天然多糖中是惟一的，赋与它许多独特的物理化学性质。 壳聚糖是一个高度弯曲折叠的纤维状的糖胺聚糖，也具有与蛋白质相似的一、二、三、四级结构，一级结构是线性链中-1,4糖苷键连接N-氨基有萄萄糖残基的顺序，不涉及次级的相互作用；二级结构是指骨架链中以氢健结合所形成的各种聚合体，二级结构只关系到壳聚糖分子主链的构象，不涉及侧链的空间排布；三级结构是指有重复顺序的一级结构和非共价相互作用造成的有序的二级结构导致空间有规则而粗大的构象；四级结构是指长链间非共价结合形成的聚集体7。壳聚糖的结构由氢键类型的不同而有三种结晶聚合形式：-壳聚糖、-壳聚糖、-壳聚糖。这三种形式的壳聚糖的主要区别在于结晶区内分子结构排列不同，-壳聚糖，由两条的反向平行的糖链组成，而-壳聚糖，由两条同向平行的分子链组成，-壳聚糖则一般认为是由两条平行链与一条反向链组成。尽管-和-壳聚糖均有C=OH-N分子间氢键，但-壳聚糖的-CH2OH基团间没有氢键的作用，而-壳聚糖有，因而-壳聚糖在水中的溶胀性比-壳聚糖好7。壳聚糖具有很好的吸附性、成纤性、成膜通透性、吸湿保湿性、生物活性等。壳聚糖的溶解度因分子量、脱乙酰度和酸的种类不同而有些差别，一般说，分子量越小，脱乙酰度越大，溶解度就越大8。1.3壳聚糖在化妆品中的应用近几年来，人们对化妆品的概念从以美容为主要目的，转向美容与护理并重，甚至以科学护理为主，兼顾美容，应用于化妆品的原料也由合成材料趋向于使用天然原料。壳聚糖作为一种资源丰富、价格低廉的天然高分子化合物，属于一种高度安全、无刺激性的皮肤调理剂，具有高度保湿性，能在皮肤表面成膜透气，络合重金属，有效清除进入皮肤的毒素，起到清洁皮肤和使皮肤光洁细腻的功效，已引起化妆品界的广泛关注。目前，在日本、法国、美国等许多大型日化公司已大量使用壳聚糖及其衍生物，国内也有以壳聚糖为原料的化妆品进入市场，将壳聚糖用于化妆品中将成为行业的一个新趋势。1.3.1护肤用品研究证明，皮下水分的散失是人的皮肤衰老的主要原因之一，正常角质层含水量10%-20%，当外界相对湿度低于60%时，角质层含水量下降到小于10%，皮肤就会显得干燥，角质层厚20微米，角质层含水量由内往外呈梯度下降，而角质层的水有结合水与游离水，在角质层内水与离子、氨基酸、蛋白质等形成结合水，结合水达到饱和状态时，于角质层细小的间隙形成水滴，形成游离水。肌肤的好坏依赖于皮肤的巧妙运作，以促其水分与脂肪的平衡及新细胞与旧细胞的更替，以及其它一切新陈代谢的顺利进行。倘若使人体生理活动理想化，自然有细嫩美丽的肌肤。然而肌肤时时都会受到外界的威胁。皮质膜、角质层以及表皮的微生物都可保护皮肤，通过调节水分、调节体温、防御以及各器官的综合作用，才能保持自然美丽的肌肤。从保湿平衡看既要让皮肤保持水分、油脂，又有NMF来保持皮肤吸水性和保湿性，从化妆品来看，要促进皮肤保水、保油。因此需往化妆品里人工添加保湿剂，通过加入高效的保湿剂来提高它的保湿效果，使得皮肤有更好保水、油的功能。根据不同的作用机理把保湿剂分为：（1）防止水分蒸发的油脂保湿，形成保湿屏障；（2）吸收外界水分的吸湿保湿；（3）结合水合作用的水合保湿；（4）修复角质层细胞的修复保湿。而壳聚糖与当今人们公认的“超级保湿剂”透明质酸相类似，具有优良的保湿性和润湿性。陈育平9的实验表明，在壳聚糖6位羟基上羧甲基化形成的羧甲基壳聚糖，引入了强亲水性的羧甲基，改善了水溶性，使其吸湿保湿性较壳聚糖有了明显的提高其吸湿保湿性也优于传统的保湿剂甘油和透明质酸，与某些化学合成的保湿剂相比较，它无毒、无害、对皮肤和眼粘膜无刺激，不存在接触过敏的问题，而且价格便宜。添加壳聚糖的洁肤、护肤液具有良好的吸湿、保湿性能。壳聚糖用于化妆美容时，很容易形成保护皮膜，其吸湿、 保水作用，可使肌肤变得柔软、湿润、延展性好。由于壳聚糖的理化性质及其结构具有易塑性的特点，在护肤化妆品中用途也较为广泛，如：膏、粉、霜、海绵等均有应用。壳聚糖吸水、保水能力较优，即使在干燥空气中也能保持占质量8%以上的水分，可应用在按摩用滑润护肤品中，其效果良好，可增加对皮肤的亲和力。壳聚糖与其他高分子物质复合制备的面膜，由于这种多糖类物质良好的亲水性、亲蛋白性，对皮肤无过敏、无刺激、无毒性反应，且在成膜过程中使得整个面膜材料与皮肤接触感明显柔和。壳聚糖本身还可以抑制黑色素形成酶-酪氨酸酶的活性，从而消除由于代谢失调而引起的黑色素。膏霜类化妆品中适量加入壳聚糖可以渗透进入皮肤毛囊孔，抑制并杀死毛囊孔中藏匿的霉菌、细菌等有害微生物，从而消除由于微生物侵害而引起的粉刺、皮炎，同时可消除由于微生物积累而引起的黑素、色斑等。壳聚糖分子结构中的游离氨基，可与金属离子如Fe3+、Mn4+等产生螯合作用，形成络合物或沉淀，对金属离子予以封锁，使产品质量提高。1.3.2护发用品壳聚糖在弱酸性条件下可成为带正电的高分子聚电解质而直接用于香波、洗发精等的配方中，使乳胶稳定化以保护胶体；壳聚糖分子中的氨基质子带正电荷，使其具有抑制静电荷的蓄积与中和负电荷的作用，这种防止带电的效能可以防止脱发；同时在保持头发的湿润、光泽、定型、柔顺、易梳理及增强头皮表皮细胞的代谢、增加头发营养的供给等方面，都具有良好的效应。壳聚糖与染料复配，同时起固发和染发作用，使头发增添色彩和光泽；壳聚糖在任一聚合步骤均不含有毒单体，在生理上有绝对的安全性。正因为壳聚糖在护法用品中显示出上述有效的特性，所以壳聚糖已经作为一种化妆品原料添加入洗发香波、发用调理剂、梳理剂、摩斯、喷发剂等五个护发品种中。此外壳聚糖类对头发和头发上的油污及头屑有吸附作用，是制备干性洗头粉的理想材料，适合用于需急干或卧床不易于水洗头的病人使用，使用后，再经梳理就可将粉连同其吸附着地油污和头屑去掉37。1.3.3美容化妆品在美容化妆品中，壳聚糖具有易成膜、皮肤调理性能好、防止皮肤干裂、粗糙及老化、加速伤口愈合、增强化妆品有效成分的透皮吸收、加速表皮细胞的代谢和再生能力的功能。从而达到减缓衰老，修饰美容的效果。添有壳聚糖的化妆品可在人体表皮上形成一道天然屏障，可以阻断或减弱紫外线和病菌等对皮肤的侵害，对紫外线和激光损伤的皮肤有很好的疗效，起到使损伤的皮肤再生，补充皮肤的水分，增加皮肤的弹性，减少炎症减轻皮肤干燥症状的作用。如果把它添加到霜膏，不但可以给皮肤提供营养成分如胶原蛋白等，而且可填充在表皮产生的干裂缝中，和表皮脂膜层中神经酰胺作用，最终和表皮长成一体，以达到修饰美容的效果。壳聚糖与染料合成着色剂，将其精制成的微粒，可以作为粉剂、唇膏、指甲油和眉笔等的底物，使它们更加易涂布和滑润，并且不易结块，毒性明显降低。1.3.4其他洗涤用品固体肥皂中加入壳聚糖和水溶性壳聚糖，能使皮肤有很好的润湿感；洗衣液中加入壳聚糖，这种生态洗涤液中所含的壳聚糖能促进水体中嗜酸乳杆菌与放线菌等有益微生物增加，抑制病原菌，并螯合重金属，加速生物降解，净化水体环境。壳聚糖及其衍生物可以预防龋齿和牙周溃疡，除去或减轻口臭。在牙膏方面，因壳聚糖的物化性能，可使牙膏膏状稳定，稠密和口感凉爽，具有药物价值。在牙膏中加入5%甲壳素无机酸或有机酸颗粒，还可以改进研磨性与外观，同时有抗菌消炎的作用，成为口腔卫生的佳品。1.4壳聚糖的改性及其应用 壳聚糖分子链上与化学性质相关的功能基团包括氨基葡萄糖单元上的 6位伯羟基、3位仲羟基和2位氨基或一些 N-乙酰氨基以及糖苷键。其中糖苷键比较稳定，不易断裂，也不与其他羟基形成氢键，乙酰氨基化学性质稳定，但参与氢键形成。通常壳聚糖的化学反应只涉及到两个羟基和氨基，容易进行如酰基化、羧基化、N-烷基化、酯化等改性1。壳聚糖由于结构上具有的羟基和氨基活性基团，可以进行形式多样的化学改性，通过特定的反应条件和方法，得到各种不同的壳聚糖衍生物。壳聚糖衍生物既能解决壳聚糖在水中或有机溶剂中的溶解性，又因有着优良的性能而广泛的用途，随着壳聚糖研究的不断深入，其衍生物必将发挥越来越重要的作用。1.4.1壳聚糖羧基化反应10在醇/碱体系中，含羧基的卤代烷与壳聚糖很容易反应得到 N，O-取代的羧基化壳聚糖衍生物。1986年，Hayes采用壳聚糖与氯乙酸反应，在碱化0.11 h、40 70oC反应2 12 h 的条件下，制得 N，O-羧甲基壳聚糖，并首次证实羧甲基取代反应同时在羟基和胺基上进行。吴刚等38采用多段升温法将壳聚糖改性，制备了取代度较高的N，O-羧甲基壳聚糖，提高了其水溶性，扩展了其用途；陈凌云39等研究了壳聚糖分子量对羧甲基壳聚糖的取代度和取代位置的影响，结果表明取代度随壳聚糖分子量的降低而增大，且不同取代位置的取代度大小为OH- 6 OH- 3 - NH2；若制备取代位置明确的羧基化壳聚糖，可先将氨基采用保护基团保护后再进行羧基化反应，得到O-羧基化壳聚糖。壳聚糖 N-羧基化可以改善壳聚糖的水溶性，另外，羧酸基团的引入，也可以得到具有类氨基酸结构的新型多糖衍生物，从而体现一些优良的物理化学及生物活性。壳聚糖N-羧基化一般有以下4种途径：（1）壳聚糖与醛酸或酮酸反应，在酸性介质中,壳聚糖与醛酸或酮酸反应能生成Schiff 碱，用NaCNBH3 或NaBH4还原，得到N-羧基化壳聚糖衍生物。（2）壳聚糖与丙烯酸(酯) 的反应，在pH 6.9的磷酸( 盐)缓冲液和乙醇混合体系( 5:3, V:V ) 中，壳聚糖与丙烯酸乙酯发生Michael亲核加成反应，生成N-丙酸乙酯壳聚糖，再用氢氧化钠水解, 得到N-羧乙基壳聚糖。（3）壳聚糖直接与酸酐反应，在酸性条件下，壳聚糖直接与酸酐反应，可以得到N-羧基化壳聚糖衍生物。（4）壳聚糖与卤代酸的反应，碱性条件下，壳聚糖与卤代酸反应能得到相应的N-羧基化壳聚糖。壳聚糖的羧基化改性不但可改善壳聚糖的水溶性，还能得到兼具-NH2和-COOH的两性壳聚糖衍生物，此类衍生物具有良好的水溶性、表面活性、成膜性、吸湿保湿性、抗菌、抗氧化等生物性能；在化妆品、食品、生物医药等方面呈现出广阔的应用前景。壳聚糖的羧基化研究最多的是羧甲基化反应。羧甲基壳聚糖因其良好的水溶性和绿色环保性, 在环保水处理、医药和化妆品等领域得到越来越广泛的应用。毒理学研究表明，羧甲基壳聚糖无任何毒副作用，在医药上可作为免疫辅助剂，具有抗癌作用而不损伤正常细胞。1.4.2壳聚糖酰化反应壳聚糖的酰化反应是化学改性研究最早的一种反应通过引入不同分子量的脂肪或芳香族酰基，所得产物在有机溶剂中的溶解度可大大改善。壳聚糖的酰化反应既可以在羟基上发生，生成酯，也可在氨基上发生，生成酰胺，但反应的活性从大到小的排列是：NH2-3OH-6OH-2。早期的酰化反应是在乙酸和酸酐或酰氯中进行的，反应条件温和，反应速度较快，但试剂消耗多、分子链断裂十分严重11 。郑化等 12以醋酸和甲醇为介质，通过饱和酸酐和壳聚糖发生酰化反应制备了N-酰化壳聚糖,并对最佳反应条件和取代度控制进行了研究。近年来的研究发现甲磺酸可代替乙酸进行酰化反应。甲磺酸既是溶剂，又是催化剂，反应在均相进行，所得产物酰化程度较高。壳聚糖上的氨基可以与甲磺酸形成弱酯而将氨基保护起来，从而使酰化反应发生在- OH 位置上。反应结束后，向体系中加入氨水进行多次中和时，得到O- 酰化壳聚糖产物。壳聚糖与邻苯二甲酸酐发生的酰化反应可以作为保护氨基的一种方法应用，但仅以DMF作为溶剂则会使反应部分发生在羟基。Keisuke14等人详细研究了DMF/H2O的比例对该反应的影响，认为当 m(DMF)Bm(H2O) = 95B5时，该反应可以较好地仅对氨基进行保护。酰化壳聚糖衍生物有很好的生物相容性，是一种潜在的医用生物高分子，并且含有羧基的酰化壳聚糖衍生物有较好的吸湿和保湿性能。汪琴等13以琥珀酸酐与壳聚糖反应制得了N-琥珀酰壳聚糖, 讨论了取代度与水溶性、吸湿、保湿性的关系，在分子量相近的情况下，N- 琥珀酰壳聚糖的吸湿、保湿性优于透明质酸。1.4.3壳聚糖烷基化反应15烷基化反应即在壳聚糖的氨基或羟基部分引入烷基，生成壳聚糖烷基化衍生物。壳聚糖分子上的氨基基团，携带有一对孤对电子，具有很强的亲核性，由于氨基的反应活性大于羟基的反应活性，与卤代烷反应较易发生N-烷基化。壳聚糖引入烷基后，其分子间氢键被显著削弱，因此烷基化壳聚糖的溶解性大大改善了，不但溶于水，而且在甲醇、乙二醇、1, 3-丁二醇、丙三醇中都可完全溶解，在氯乙醇、丙二醇中部分溶解，在甲酰、N，N-二甲基甲酰胺二甲亚砜等溶剂中溶胀。烷基化壳聚糖具有水溶性，吸附性，抑菌性等优良的性能，为壳聚糖的开发利用带来了广阔的前景。另外其具有良好的成膜性、增粘性、防静电和防尘性,所以被大量用在化妆品工业上。如双二正丙基壳聚糖能与阴离子洗涤剂相容，适用于洗发香波。1.4.3.1与卤代烷发生烷基化反应壳聚糖的氨基位、C6 羟基位均可与卤代烷发生取代反应引入烷基，可选择性的进行O位烷基化、N位烷基化、N，O 位烷基化。1.4.3.1.1O位烷基化如果直接进行烷基化反应，在N，O位上都可以发生反应。为了选择在O上发生烷基化壳聚糖反应，必须先对N-进行保护，通常保护氨基的方法有希夫碱法。希夫碱氨基保护法是先将壳聚糖与醛反应形成希夫碱，再用卤代烷进行烷基化反应，然后在醇酸溶液中脱去保护基，既得到只O-取代的衍生物。反应过程如下：图1-1 壳聚糖的O-烷基化反应方程式Fig .1-1 Curing formula of O-Alkylation in Chitosan1.4.3.1.2N位烷基化壳聚糖分子上的氨基基团，携带有一对孤对电子，与卤代烷反应，可得到相应的N-烷基化产物。汪敏等 16采用溴化十六烷基三甲基铵( CTAB) 作相转移催化剂( PTC)，在氢氧化钠水溶液进行低聚水溶性壳聚糖的双亲性N-十六烷基化修饰改性反应，并研究了反应介质、催化剂种类、碱的用量、烷化剂用量、反应时间、反应温度等因素对壳聚糖衍生反应的影响，反应过程如下所示：图1-2 壳聚糖的N-烷基化反应方程式Fig.1-2 Curing formula of N-Alkylation in Chitosan1.4.3.1.3N,O位烷基化在碱性条件下，壳聚糖与卤代烷直接反应，可制在N，O 位同时取代的衍生物。反应条件不同，产物的溶解性能有较大的差别。该类衍生物也有较好的生物相容性，有望在生物医用材料方面得到应用。1.4.3.2与长链脂肪酰反应壳聚糖与脂肪酰( 酸酐、 酰卤等)的反应易发生在氨基上。通常情况下, 直链脂肪酰衍生物( 甲酰、己酰等) 可在甲醇或吡啶/氯仿溶液中制得。支链脂肪酰基衍生物( N-异戊酰基) 可在甲酰胺溶液中反应。1.4.3.3与高级脂肪醛反应烷基化衍生物的合成，通常是采用醛与壳聚糖分子中的NH2反应形成希夫碱，然后用NaBH3CN或NaBH4还原来得到目标衍生物的。其合成路线如下所示图1-3 壳聚糖与高级脂肪醛的反应方程式Fig.1-3 Curing formula of chitosan and higher fatty aldehydes长链N-烷基化壳聚糖衍生物因具有双亲性，可用于自组装药用微囊的制备，但用高级脂肪醛通过席夫碱反应改性，因系两相反应，取代度低，可采用加入相转移催化剂微波辐射的方法提高N-烷基化壳聚糖的取代度,缩短反应的时间。1.4.3.4与环氧衍生物反应壳聚糖与环氧衍生物进行加成反应，可得到烷基化衍生物，此反应的特点是可同时引进亲水性的羟基，如壳聚糖与过量的环氧衍生物在水溶液中反应时，其分子氨基上的2个H都被取代，生成的产物易溶于水。1.4.4 壳聚糖酯化反应常见的酯化反应有硫酸酯化和磷酸酯化。壳聚糖经硫酸酯化后得到类似于肝素的壳聚糖衍生物，具有较好的抗凝血功能且没有副作用；磺化羟基化交联壳聚糖对血清中的低密度脂蛋白(LDL)具有选择吸附性能,是降低冠状动脉粥样硬化发病率的有效途径之一。硫酸酯化反应一般为非均相反应，常用的试剂有浓硫酸、SO2/ SO3、氯磺酸/吡啶和 SO3/ 吡啶、O3/DMF等，反应既可在氨基上发生也可在羟基上发生，以羟基上反应为主。使用强酸介质中氨基质子化的方法也可制得酯化位置明确的酯化产物17，Baumann H采用Cu2+和邻苯二甲酸酐对2- 位氨基和3- 位仲羟基进行保护后再硫酸酯化的方法制备了酯化位置明确的壳聚糖衍生物18。磷酸酯化反应一般是在甲磺酸中与甲壳素或壳聚糖反应，高取代度的磷酸酯化壳聚糖可溶于水，低取代度的壳聚糖衍生物不能溶于水。保湿剂、吸湿剂的保湿性都依赖于保湿剂对水分子作用力的大小，作用力大，则吸湿率增加；壳聚糖是一种有很好的吸湿性、保湿性吸附性、成膜性和通透性的生物高分子，但壳聚糖与透明质酸相比，其吸湿、保湿效力较差，因此可以通过对壳聚糖的结构修饰，在壳聚糖分子中引入强亲水集团，增强壳聚糖的水合能力，提高其吸湿、保湿效能，水溶性壳聚糖及其衍生物的研究成为一个大家关注的方向。陈凌云等19研究了羧基壳聚糖的取代度及保湿性，结论表明保湿性能随取代度的增加而增强。王勤20等人对季铵化水溶壳聚糖的制备及其保湿进行了表征。但目前还没有相关文献对壳聚糖硫酸酯的吸湿、保湿性能进行表征，本文研究了壳聚糖硫酸酯的保湿、吸湿能力，为以后壳聚糖硫酸酯这类衍生物在化妆品方面的应用提供参考。1.5胶原蛋白的简介 胶原蛋白广泛存在于动物骨、腱、软骨和皮肤及其它结缔组织中，是细胞外基质的主要成分，约占动物体胶原纤维固体物的 85%，占体内蛋白质总量的25% 30%，具有支撑器官、保护机体的功能。它是由动物的成纤维细胞合成的一种生物高分子，是一种白色、不透明、无支链的纤维型蛋白质。胶原蛋白是动物体内含量最丰富的蛋白质，占人体皮肤蛋白质的71.2%；皮肤一旦缺乏胶原蛋白，胶原纤维就会发生交联固化，使细胞间黏多糖减少，皮肤失去弹性变薄老化，导致真皮纤维断裂，脂肪萎缩，汗腺及皮肤腺分泌减少，是皮肤出现色斑、皱纹等一系列老化现象；如果能够从外补充胶原可介导或者加强细胞与胶原作用，使细胞形态和生理、生化显著改变，达到皮肤保养的效果。胶原蛋白作为一种纤维蛋白，其基本组成单位是原胶原分子，原胶原分子是由三股- 螺旋结构的肽链缠绕形成的纤维状蛋白，长度约为300nm，直径约1.5 nm，分子量为300 kDa 胶原中含有大量的甘氨酸，约占总氨基酸残基的1 / 3；其次是脯氨酸和羟脯氨酸含量高达 15% 30%，这两种氨基酸为胶原所特有，但色氨酸、酪氨酸及蛋氨酸等必需氨基酸含量低，所以，从营养角度上看，胶原属于不完全蛋白质19。胶原蛋白具有一般蛋白质的化学性质，如发生氨基反应、羧基反应、胍基反应、甲硫基反应等，另外，还能与酸、碱反应发生胶解，具有自身特定的等电点。胶原蛋白的特殊性在于，由于胶原蛋白分子表面有许多极性侧基，赋予了其非同一般的吸水性能，可以结合自身质量10倍以上的水，而其本身不溶于水21。张忠楷等22对胶原蛋白、明胶和水解胶原蛋白的护肤功能比较，胶原的吸湿性优于明胶和水解胶原蛋白；胶原、明胶和水解胶原蛋白都能渗透至毛囊中，但只有胶原仍均匀分布于皮肤表面，显示其优良的保湿功能；只有胶原能明显促进细胞的生长和繁殖，而在明胶和水解胶原蛋白上培养的角质形成细胞的生长情况与参比样相似。因此，胶原比明胶和水解胶原蛋白具有更优良的吸湿、保湿性能以及抗皮肤衰老功效。1.6胶原蛋白对皮肤的作用人类表皮分为基底层、棘细胞层、颗粒层、透明层、角质层等，是处于不断更新再生的组织，基底层细胞粘附到和真皮分界的基底膜上，表皮的分化伴随有基底细胞粘附的减少，不断分裂，逐渐向上推移、角化、变形,形成角质层以至最后脱落。每人每天约有6 14 g鳞屑脱落，胶原蛋白在调节表皮更新再生中发挥重要的作用，胶原蛋白可促进细胞粘附和细胞增殖23。胶原蛋白可以被表皮吸收，但不能进入真皮,对角质化的细胞有作用。胶原蛋白存在于真皮层，且占皮肤组成成分的70%。当人活动时，皮肤中胶原蛋白发挥作用，使皮肤具有保护功能，同时又具有适当弹性及坚硬度。胶原蛋白是维持皮肤与肌肉弹性的主要成分，能促使肌肉细胞连接并使其具有弹性与光泽。胶原蛋白能有效地改善皮肤表皮和真皮结构，促进皮肤内胶原的合成。胶原蛋白用于化妆品中的主要功效如下：(1) 亲和性：胶原蛋白对皮肤和头发表面的蛋白质分子有较大的亲和力，胶原蛋白主要通过物理吸附与皮肤和头发结合，能耐漂洗处理。这些分子可以渗入皮肤表皮和头发，甚至皮质，达到营养皮肤的作用。(2) 修复性：胶原蛋白具有良好的生物学特性，可谓表皮细胞的迁移、增殖铺垫支架，并提供良好的营养，促进皮肤及神经增长，有利于上皮细胞的增生修复，从而促进创面的愈合，胶原蛋白可用于小型皮肤缺损修复及组织缺损修复,是理想的医用美容材料。(3) 美白：人类皮肤的颜色由黑素的含量与分布决定的。黑素主要是醌型聚合物，胶原多肽中含有酪氨酸残基，由于化学结构的相似性，化妆品中添加的胶原多肽的酪氨酸残基与皮肤中的酪氨酸竞争，与酪氨酸酶的活性中心结合，从而抑制酪氨酸酶催化酪氨酸转化为多巴醌，阻止皮肤中黑素的形成，达到美白作用。(4) 营养性：可以补充皮肤层所需的养分，补充17 种对人体有益的氨基酸，使皮肤中的胶原蛋白活性增加，保持角质层水分以及纤维结构的完整性，改善皮肤细胞生存环境和促进皮肤组织的新陈代谢，增强循环，达到滋润皮肤、延缓衰老、美容、消皱、养发的目的。 (5)保湿性：天然保湿因子是保持皮肤水分的重要物质,其主要成分是甘氨酸、羟脯氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸、丝氨酸等游离的氨基酸。另外，胶原分子外侧亲水基团羧基和羟基等的大量存在，使胶原分子极易与水形成氢键，因此胶原蛋白及多肽具有良好的保水保湿性能。(6) 配伍性：胶原蛋白可以起到调节和稳定pH值，稳定泡沫，乳化胶体的作用。同时，作为一种功能性成分在化妆品中可以减轻各种表面活性剂、酸、碱等刺激性物质对毛发、皮肤的损害。1.7胶原蛋白在化妆品中的应用21 胶原蛋白独特的纤维状结构，良好的生物相容性和抵抗原性使其成为高档化妆品的热门研究课题，尤其是因为胶原蛋白的美容功效，它具有营养性、修复性、保湿性、防皱、美白、亲和性等作用，使胶原蛋白的这些美容作用，已经广泛应用于化妆品中。1.7.1美容品胶原蛋白虽不是肌肉组织的主要组成物质，但它与肌肉生长有着密切关系对于处于生长阶段的青少年来说，补充胶原蛋白能够促进生长激素分泌以及肌肉生长而对于想保持体形的成年人，塑造结实健美的肌肉也需要补充胶原蛋白。1.7.2护肤品由于胶原与人皮肤胶原的结构相似，亲和性好，可以扩散到皮肤的深层，供给皮肤所必需的养分，且胶原蛋白分子外侧存在大量的羧基、羟基，提高与水的亲和性，从而改善组织细胞的贮水能力，使皮肤保湿；皮肤对胶原蛋白有很好的吸收作用，而胶原蛋白有使受损老化的皮肤得到填充和修复，达到延缓皮肤衰老的目的。因而广泛应用于化妆品行业，现如今市场中销售的面膜、眼霜和护肤霜等化妆品中很多都含有胶原蛋白。1.8胶原蛋白/壳聚糖胶囊壳聚糖及其衍生物作为药物载体，能稳定或保护有效成分，促进药物的吸收，延缓或控制药物释放，帮助药物送达靶向器官组织而发挥独特的作用。在医药领域中，研究者们将壳聚糖制成微球或微胶囊等用于控释系统。壳聚糖在药物释放方面应用的原因是壳聚糖的亲水性，使得一些药物释放速率过快,难以达到缓释和控释的目的15。 纳米和微米级的壳聚糖尤适合于控制药物的释放。作为固定化酶和药物的载体壳聚糖是一种网状载体，具有机械性能良好北学性质稳定、耐热性强等优点。特别是分子中存在的氨基，既易于与蛋白质或酶结合，又可络合金属离子，使酶免受金属离子的抑制，同时它又易于通过接枝而改性。因此，它是一种良好的蛋白质和酶的载体。现已成功地在壳聚糖上固定了碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、淀粉酶 、天冬氨酸酶、纤维素及半纤维素酶等。利用壳聚糖对酶的固定化技术常用的方法是将酶包埋在载体上，或通过醛桥将酶固定到载体上等。现在日本已经具有专用于固定酶用的壳聚糖多孔颗粒商品出售24。目前制备壳聚糖微球的常用方法有：乳化交联法、离子沉淀法、相分离法、喷雾干燥法、离子凝胶法等25。随着生物制药技术的迅猛发展，多肽和蛋白质类药物制剂的研究开发日益受到广泛的关注，对于壳聚糖如何用于蛋白质类、多肽类药物的制剂化，是此领域的新兴热点，具有巨大的市场潜力。近年来,国内外有大量文献报道用壳聚糖修饰脂质体、微球、微囊等递药系统。采用壳聚糖制备微球，可控制药物的释放，改善易降解物质 (如蛋白)的生物利用度，增强亲水性药物通过上皮层的渗透性。谢宇26研究了壳聚糖纳米微球对牛血清蛋白的包封和缓释效果。但目前文献报道的壳聚糖包裹蛋白质制成微球大都应用在医药领域。还没有相关报道壳聚糖包裹营养性物质应用在化妆品上。因此本文探讨壳聚糖包裹营养性护肤品：胶原蛋白，制备出微球，添加入化妆品中，为以后壳聚糖微球在化妆品方面的应用提供参考。19本课题研究的内容及其意义目前，壳聚糖衍生物有望作吸湿保湿剂的有：羧甲基壳聚糖、羧丙基壳聚糖、季铵盐基壳聚糖，为了拓宽壳聚糖衍生物在化妆品中的应用，本文研究了壳聚糖硫酸酯的吸湿、保湿能力。壳聚糖是一种良好的蛋白质和酶的载体，目前也有相关文献报道壳聚糖包裹蛋白质制备成具有缓释效果的微球，但局限于医药方面的使用。本文研究了壳聚糖包裹营养性护肤品：胶原蛋白，作化妆品添加剂使用，为以后壳聚糖微球在化妆品方面的应用提供参考。论文主要进行了一下几个方面的研究：（1）用浓硫酸/DMF对壳聚糖进行硫酸酯，并确定最佳的制备条件。（2）对壳聚糖硫酸酯与壳聚糖的吸湿、保湿性进行表征。（3）用乳化交联法制备了载胶原蛋白的壳聚糖微球，通过体外释放研究检测其释放性能。2. 实验部分2.1实验仪器及药品2.1.1实验仪器表1 实验仪器Tab 1 Experimental apparatus仪器 型号生产厂家离心沉淀机80-1型巩义市英峪予华仪器厂予华牌循环水真空泵SHZ-D巩义市英峪予华仪器有限责任公司智能磁力加热搅拌器SZCL型巩义市英峪予华仪器有限公司电热鼓风干燥箱真空干燥箱远红外快速干燥器偏显微镜101A-2B型DZF-6050型WS70-150 型上海实验仪器厂有限公司上海博讯实业有限公司沪越科学实验仪器厂Nikon公司激光粒度仪Mastersizer 2000型Malvern公司紫外-可见分光光度计UV-2550型Shimadzu公司W多功能电动搅拌器D-8401型天津市华兴科学仪器厂光学显微镜XSP-16A型南京江南光电集团股份有限公司红外光谱仪RPrestige-21型Shimadzu公司电子天平FA1004型上海良平仪器仪表有限公司2.1.2实验药品表2 实验药品Tab 2 Experimental drugs药品名称纯度生产厂家浓硫酸A.R北京北化精细化学品有限公司二甲基甲酰胺A.R.成都市科龙化工试剂厂冰醋酸A.R.天津市科密欧大茂化学试剂有限公司壳聚糖Span80硬脂酸镁无水乙醇环氧氯丙烷液体石蜡A.R.C.R.A.R.A.R.A.R.A.R.上海崚峰化学试剂有限公司天津大茂化学试剂厂天津市科密欧大茂化学试剂有限公司天津大茂化学试剂厂天津大茂化学试剂厂天津大茂化学试剂厂胶原蛋白A.R.禾大化学品（深圳）贸易有限公司溴化钾A.R.天津大茂化学试剂厂磷酸二氢钾BPO天津市科密欧大茂化学试剂有限公司磷酸氢二钠A.R.天津市科密欧大茂化学试剂有限公司氢氧化钾A.R.天津大茂化学试剂厂氢氧化钠A.R.天天津大茂化学试剂厂2.2 实验流程2.2.1 壳聚糖硫酸酯的制备2.2.1.1 合成方式壳聚糖硫酸酯的合成化学方程式：壳聚糖的糖残基上都有羟基，可与多种物质发生反应。它们的糖残基上有两种羟基，一种是C6-OH，这是一级羟基；另一种是C3-OH，这是二级羟基。C6-OH既是一级羟基，在空间构象上来说，又可以较为自由地旋转，位阻也小，而C3-OH是二级羟基，不能自由旋转，空间位阻也大一些，所以O-衍生物主要发生在C6-OH位。在酸性介质中，壳聚糖2-位胺基已质子化，不再与酯化剂作用, 这样利于6-位羟基的取代反应,可得到6-位成酯化水溶性产物，其反应化学方程式如下：图2-1 C6-硫酸酯化反应方程式Fig.2-1 Curing formula of C6-sulfated硫酸在浓度较大的情况下,常出现一级电离, 电离式如下:图2-2 浓硫酸的一级电离方程式Fig.2-2 Lonization formula of sulfuric acid电离出的H+与壳聚糖的氨基很容易成阳离子,而OSO3H-又与壳聚糖氨基阳离子成盐,在较大浓度的硫酸存在的情况下, 此盐很容易以下列形式脱去一分子水,最后形成在 N 上取代的磺酸根, 也就形成了壳聚糖2-NH2上磺化的衍生物27。具体表示如下:图2-3 N3-硫酸酯化反应方程式Fig.2-3 Curing formula of N3-sulfated2.2.1.2壳聚糖乙酸溶液的制备壳聚糖由于分子中存在强大的氢键作用,使其大分子间存在着有序结构, 因此难以熔化,也难于溶解于水、稀酸碱溶液和多数有机溶剂。壳聚糖的硫酸酯化反应中，用磺化剂或磺化溶剂直接磺化不经任何预处理壳聚糖,由于壳聚糖本身的结构特点,反应结果不是很理想。因此对壳聚糖进行活化处理，打破壳聚糖分子间强烈的氢键,使壳聚糖以疏松的状态存在,从而达到加快反应进程的效果27。 本实验是将1g壳聚糖溶于17ml的1.5%乙酸溶液中，并对其进行搅拌，得到壳聚糖乙酸溶液。2.2.1.3硫酸酯化体系的选择有机溶剂在有机反应中的作用是不可忽视的。溶剂不同,反应效果相差悬殊。在壳聚糖硫酸酯化体系的溶剂选择上,溶剂的作用优劣集中表现在对壳聚糖硫酸酯的溶解能力和络合硫酸酯剂的能力。就最近的研究文献28,壳聚糖的硫酸酯化体系所用的溶剂基本上是吡啶、甲酰胺、二甲基甲酰胺。这3种溶剂各有优缺点,吡啶的毒性很大且有恶臭味,但很多学者仍在使用；甲酰胺对硫酸酯化剂的溶解能力比较强,但不易干燥。二甲基甲酰胺对硫酸酯化剂的溶解能力不是很强,它的优点是容易干燥,性质温和,毒性较小,所以被较多的研究者采用。 硫酸酯化剂的选择主要是依据反应过程控制的难易程度和反应装置的情况。硫酸酯化剂的种类很多,三氧化硫、浓硫酸和发烟硫酸、氯磺酸等。从理论上讲 ,三氧化硫是最有效的硫酸酯化剂。反应中直接引入- SO3H,反应容易进行，可进行等摩尔反应 ,所得的硫酸酯盐产物中含盐量最少。用氯磺酸硫酸酯化可以在室温下进行,操作方便,适用与间歇工艺生产,氯磺酸可单独使用,也可在溶剂中使用浓硫酸和发烟硫酸的应用范围很广,反应速度随酸浓度的下降呈数量级的下降,要保持高转化率则需要使用过量的硫酸酯化剂28。本实验选用二甲基甲酰胺作为有机溶剂，浓硫酸作为硫酸酯化剂。一定量的二甲基甲酰胺、浓硫酸，在5以下的冰水浴中搅拌均匀，形成硫酸酯化体系。2.2.1.4壳聚糖硫酸酯化向装有搅拌装置的密闭三口烧瓶中加入一定量的有机溶剂DMF(预先冷却),置于冰水浴中。在搅拌状态下,滴加一定体积硫酸酯化剂浓硫酸,控制滴加的速度,使反应体系的温度保持在5以下快速搅拌使之混合均匀。生成硫酸酯化体系，待用。向另一装有搅拌装置的密闭三口烧瓶中加入一定量的壳聚糖乙酸溶液，在搅拌状态下，滴加一定量的DMF/浓硫酸的硫酸酯化体系，滴加完毕后在一定温度下继续搅拌一定时间,形成壳聚糖硫酸酯粘稠的溶液29。2.2.1.5壳聚糖硫酸酯粗品后处理硫酸酯化/磺化壳聚糖的纯化方法直接影响其特性的研究。文献已报道有冷冻干燥、渗析、沉淀等提纯方法。但采用冷冻干燥法不易完全提纯；若采用渗析法，在不知道产物分子量的情况下,难以选择合适的渗透膜。故在此采用沉淀提纯法。这种后处理方法较为简单,而且容易控制。即将凝胶状反应混合物倒入5倍体积冰冻酒精中混合,待其沉淀完全时；再用m(水)：m（乙醇）=3:7的混合溶液反复洗涤、浸渍、滤去乙醇液，直至其滤液PH=6.4左右。取v（乙醇滤液）：v（异丙醇）=1:1于试管中，振荡混合均匀，观察现象，无沉淀产生，说明壳聚糖硫酸酯没有溶解于乙醇洗涤液中。将沉淀于50真空干燥至恒重后 ,放入干燥器备用27。2.2.2壳聚糖硫酸酯的性能检测2.2.2.1 红外光谱测定将一定量干燥后的KBr和壳聚糖硫酸酯置于玛瑙研钵中，研磨均匀，尽量成粉末状，装样，手动压片，取出样品小心轻放入样品室。采用傅里叶变换红外光谱仪对样品在4 0 04000cm-1区间扫描。2