嗜酸氧化硫硫杆菌的分离鉴定.doc

嗜酸氧化硫硫杆菌的分离鉴定嗜酸氧化硫硫杆菌78（Acidithiobacillus thiooxidans At.t）是一类硫氧化细菌的总称，它们在形态学和生理学上存在着多样性，而且可能是不同种类的细菌79。嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans, At.f）和嗜酸氧化硫硫杆菌是目前在生物冶金方面研究最多、最重要的两种菌。氧化亚铁硫杆菌利用铁源浸矿时会在矿物表面形成硫层，阻碍进一步浸矿，而嗜酸氧化硫硫杆菌却可以利用硫，将阻碍浸矿的硫层除去80，因而它在浸矿中的作用尤为重要。本文从土壤样品中分离纯化出了一株硫氧化细菌，对其进行了形态学、生理生化特征和16S rDNA鉴定和分析，为后面探讨其浸矿机理奠定基础。鉴定结果表明此菌属于嗜酸氧化硫硫杆菌，命名为HY-01。2.1 试剂与材料2.1.1 菌种来源实验所用菌株为本实验室从湖北大冶铜山口酸性土壤中分离所得；大肠杆菌为本实验室保存菌种。2.1.2 主要试剂升华硫，化学纯，天津市福晨化学试剂厂；琼脂粉，生化试剂，国药集团化学试剂有限公司；蛋白胨，生化试剂，日本进口；酵母抽提物，生化试剂，日本进口；二苯胺磺酸钠，化学纯，国营昆山化工试剂厂；乙二胺四乙酸钠，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；其余试剂均为国药集团化学试剂有限公司分析纯。2.1.3 培养基实验室使用的各种培养基配方如下：Waksman 培养基81：(NH4)2SO4 0.2 g，K2HPO43H2O 3.0 g，MgSO47H2O 0.5 g，CaCl22H2O 0.126 g，S0 10.0 g，蒸馏水1000 mL，pH=2.0。Starky-Na2S2O3-琼脂培养基81：(NH4)2SO4 2.0 g，MgSO47H2O 0.5 g，CaCl22H2O 0.25 g，KH2PO4 3.0 g，FeSO47H2O 0.001 g，Na2S2O3 10 g，琼脂 3.0 g，蒸馏水 1000 mL。基础培养基：(NH4) 2SO4 0.2 g，K2HPO43H2O 3.0 g，MgSO47H2O 0.5 g，CaCl22H2O 0.126 g，蒸馏水1000 mL，pH=2.0。LB培养基：1 g蛋白胨，0.5 g酵母提取物，1 g NaCl，溶于100 mL蒸馏水中，pH=7.0。2.1.4 缓冲液1 STE缓冲液：Tris-HCl（pH7.6）0.2 mol/L，NaCl 0.5 mol/L，SDS 0.1%，EDTA 0.01 mol/L；2 TE缓冲液：Tris-HCl 10 mmol/L（pH7.6），EDTA 0.001 mol/L；3 50TAE缓冲液：242 g Tris碱，57.1 mL冰醋酸，100 mL 0.5 mol/mL EDTA(pH 8.0)，加双蒸水至1L。电泳缓冲液常用0.5TAE缓冲液；4 10%SDS溶液：10%（w/w）的十二烷基磺酸钠溶解于蒸馏水中，可加热到68溶解。5 醋酸铵缓冲液：取醋酸铵100 g，加水300 mL使溶解，加冰醋酸7 mL，摇均即得。2.1.5 酶及试剂盒1 酶：Taq DNA 聚合酶购自武汉鼎国生物技术有限公司，T4DNA连接酶购自Takara公司，溶菌酶，蛋白酶K，Rnase，均为上海生工产品。2 试剂盒：PCR产物纯化试剂盒，GenExtractTM质粒小量快速提取试剂盒，PMD-18 Vector连接试剂盒，均为Takara公司产品；DNA Marker (DL2,000)，Loading buffer购自武汉鼎国生物技术有限公司。2.1.6 引物合成与测序扩增16S rDNA的PCR扩增引物为：Pf：5-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3Pr：5-AAGGAGGTGATCCAGCC-3引物由武汉鼎国生物技术有限公司合成，测序由六合华大基因科技股份有限公司完成。2.1.7 主要仪器设备表2.1 主要仪器与设备Table2.1The main equipments型号名称生产厂家3K30型台式冷冻离心机SIGMASPX-250B-Z型生化培养箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂HZ200LB型恒温培养摇床武汉瑞华仪器设备责任有限公司UV-2000型紫外-可见分光光度计龙尼柯（上海）仪器有限公司DELTA 320pH计Mettle-Toledo Group（上海）有限公司YX280A手提式不锈钢蒸汽消毒器上海三申医疗器械有限公司85-2型磁力恒温搅拌器上海司乐仪器厂FM70型制冰机格兰特公司PCR仪德国eppendorf公司3K30台式冷冻离心机SIGMA2.2 试验方法2.2.1 土样采集与处理将取样瓶与取样勺用牛皮纸炸好后，于121 高压灭菌。在取样地点打开牛皮纸，用取样勺取土壤样品至取样瓶中，瓶口在酒精灯焰上灼烧，然后迅速扎好牛皮纸带回。称取土样10 g到盛有100 mL无菌水的烧杯中，加入磁力搅拌子，在磁力搅拌器上搅拌1 h，然后静置。烧杯和磁子使用前经过高压灭菌，以保证操作过程为无菌操作。2.2.2 富集培养从自然界中采集而来的土样样品，虽然其中有硫氧化细菌生存，但自然条件中营养物质相对较少，而且多种微生物在同一环境中共生，形成了一个多种微生物的群落体系82。不同种群微生物之间还存在着对有限营养物质的竞争，使得各种菌群之间达到了相对平衡的状态，某一菌群不具有绝对优势，菌浓度一般都低于107个/mL。此外，野生菌的生长活性也比较低，要进行富集培养83。富集培养主要是依据微生物生长特性，通过控制培养基及温度等环境条件，使能够适应该条件的微生物旺盛生长84，从而数量增加直至成为优势菌种，以更利于从中分离出所需菌种。吸取土样处理静置后的上清液10 mL，接种到盛有到盛有 100 mL 已灭菌Waksman 培养基的 250 mL 锥形瓶中，置于 30 、 150 rpm的恒温摇床中培养。培养7 d10 d，直至培养基变成浑浊的乳白色。从中吸取10 mL接种到新鲜的Waksman培养基中，如此重复操作，富集培养四五代之后，使得嗜酸氧化硫硫杆菌成为其中的优势菌群。2.2.3 分离纯化富集培养后的菌液中，虽然目的菌群占优势，仍有其他杂菌存在，必须经过分离纯化才能获得纯培养。常用的分离方法有稀释涂布平板法和划线分离法。本实验采用第一种方法。吸取富集后的菌液1 mL，接入装有9 mL无菌水的试管中。摇晃均匀后，从中取1 mL到下一个9 mL无菌水试管中，如此重复操作将菌液稀释成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6浓度的稀释液。吸取10-4，10-5，10-6三个浓度的稀释液各0.2 mL，分别接种到不同的Starky-Na2S2O3-琼脂固体培养基上，用涂布棒涂布均匀。每个浓度重复三块平板。培养皿上做相应记录。室温下放置2 h 后，于30培养箱中倒置培养。稀释涂布平板法具体操作见图2.1。培养 7 d10 d后，Starky-Na2S2O3-琼脂固体培养基上出现圆形凸起状小菌落（直径1 mm左右）。用牙签将单菌落挑起，接种到装有10 mL 液体培养基的小锥形瓶（或试管）中，以纱布封口培养，直到小锥形瓶（试管）的液体变成乳白色且均匀浑浊。重复以上操作，反复分离纯化，最后分离得到优良菌株。图2.1稀释涂布平板法Table2.1 The method of dilute bacterium and spread plate2.2.4 菌种的形态学观察将处于对数生长期的菌液滴加一滴到载玻片上，在光学显微镜下观察菌体的运动性；经过革兰氏染色辨别其阴性、阳性；革兰氏染色一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作如下：a、涂片固定：将菌液滴加在载玻片上后在酒精灯火焰上灼烧或室温干燥；b、初染：滴加草酸铵结晶紫染色1 min，用自来水冲洗；c、媒染：加碘液覆盖涂面1 min，用自来水冲洗；d、脱色：加95%乙醇数滴，轻轻摇动载玻片进行脱色，0.5 min后自来水冲洗；e、复染：用番红染液染色0.5 min后自来水冲洗，干燥后镜检。另外，将细胞经过预处理、固定、喷金后用扫描电镜观察菌体形状。2.2.5 菌种的生理生化特性a、最适生长条件。控制相同的接种量，将菌种接种到Waksman培养基中，分别在不同的温度和pH值条件下培养。7 d后观察细菌的生长情况以确定最适宜温度和pH值。b、生长曲线。将相同量的菌种分别接种到Waksman培养基和Na2S2O3培养基中，每12 h测定测定一次其在600 nm处的吸光值85。c、能源利用特征80。在基础培养基中添加下面任一种物质作为能源来培养菌种，传代培养3代之后采用血球计数板直接计数法测定细胞浓度，确定细菌对各种能源的利用情况。能源物质分别是：单质硫（10 g/L），硫代硫酸钠（10 g/L），蛋白胨（1 g/L），酵母抽提物（10 g/L），葡萄糖（1 g/L），硫（5 g/L）和蛋白胨（0.1 g/L），硫（5 g/L）和酵母抽提物（0.1 g/L），硫（5 g/L）和葡萄糖（0.1 g/L），硫酸亚铁（44.7 g/L），黄铁矿（10 g/L）。d、氮源利用实验。用0.1%无机氮源或0.5%的有机氮源来替代Waksman培养基中的(NH4)2SO4，传代培养3代后用显微镜检查结果。2.2.6 菌种的16S rDNA鉴定菌种16S rDNA鉴定的流程示意图如下：基因组DNA提取PCR扩增纯化回收与PMD-18载体连接转化质粒PCR（鉴定）提取质粒测序图2.2 16S rDNA鉴定流程图Fig.2.2 The fluidogram of 16S rDNA2.2.6.1基因组DNA的提取861 细胞收集：将100 mL纯化后培养的细菌菌液转移到离心管中，2000 rpm离心10 min除去菌液中的硫粉，然后8000 rpm离心15 min，倒掉上清液，将细胞重悬于5 mL STE缓冲液中；2 8000 rpm离心10 min，弃去上清液；3 将细胞重悬于4 mL TE缓冲液中，加入8L 溶菌酶，37 保温20 min；4 加入Rnase 10 L，10% SDS缓冲液500 L，37 保温30 min；5 加入10 L蛋白酶K，37 保温1 h；6 加入等体积的苯酚，8000 rpm离心5 min；7 吸取上清液放入新的离心管中，再加入等体积的苯酚：氯仿（体积比为1：1）抽提液，盖上盖，振荡1min，使充分混合，8000 rpm离心5 min；8 吸取上清液，加入1/5体积的醋酸铵缓冲液，2倍体积的无水乙醇，慢慢旋转离心管，看到有丝状DNA出现，8000 rpm离心5 min收集核酸沉淀；9 沉淀用70%的乙醇清洗2次，无水乙醇清洗1次，于室温下晾干，将沉淀溶于0.5 mL TE缓冲液中，-20 保存备用。2.2.6.2 DNA的PCR扩增将参与PCR反应的基因组、酶和各种缓冲液加入到反应管中，放入PCR仪中进行扩增。PCR反应体系（25L）：材料名称加入量基因组DNA模板1 L42.5 mmol/L dNTP2.5 L10Taq DNA聚合酶缓冲液5 L2.5 mol/L 引物25 LMgCl2 缓冲液2.5 LTaq DNA聚合酶0.5 L最后用双蒸水补加到25L扩增程序：95 ，5 min；（94 ，45 s；，1 min；72 ，90 s）进行15个循环；（94 ，45 s；50 ，1 min；72 ，90 s）进行20个循环；72 ，10 min；4 ，Pause。2.2.6.3DNA的电泳分离采用琼脂糖凝胶电泳，根据DNA片段大小配制琼脂糖浓度为1.0%，在琼脂糖中加入溴化乙锭，使其浓度为0.5 g/mL，电泳时控制电压在510V/cm。观察或拍照时在254 nm的紫外光下操作，从凝胶上回收样品时在366 nm的紫外下操作。2.2.6.4DNA片段的回收和纯化（参照道普生物科技琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒V3.0）1用琼脂糖胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀切下所要回收DNA的琼脂块，放入到1.5ml离心管中，要尽可能避免长时间的紫外照射；2加入RJ Solution（按每100 mg琼脂糖胶加入300 L RJ Solution为一次标准反应），5060水浴510分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，直至胶完全溶化。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶剂或多放几分钟；3将溶液转移到吸附中，室温放置1min。12000rpm，离心1min；4取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，加入600 L Wash Buffer，12000 rpm，离心1min；5重复步骤4一次；6取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，12000 rpm，离心3 min，室温放置35min。（尽量除去Wash Buffer）；7将吸附柱放入新的1.5 mL离心管中，在柱子膜中央加入适量Elution Buffer（3050L，洗脱体积不要小于30 L），Elution Buffer的加量应该根据回收前DNA量来决定，室温放置2 min；812000 rpm，离心1 min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，立即放于-20备用；2.2.6.5DNA片段与PMD-18载体连接加样：回收纯化的DNA：10 L PMD-18 Vector：1 L 10T4 DNA Ligase Buffer：2 L T4 DNA Ligase：1 L 双蒸水：6 L将样品加至0.2 L EP管中，手指轻弹混匀后放置于16连接1216 h。2.2.6.6大肠杆菌感受态细胞的制备和转化1接种大肠杆菌于5 mL LB培养基中37振荡培养过夜，按1%接种到新的50 mL LB培养基，37 振荡培养约2 h，菌液呈毛玻璃状即可；2将菌液转移到50 mL预冷无菌的离心管中，冰浴冷却10分钟，4,000 rpm离心10 min，弃上清，将离心管倒置1 min，使培养基流尽；3细胞沉淀用CaCl2溶液重悬，于4 以1,000 rpm离心5 min；4用冰冷的0.1 mol/L CaCl2 5 mL悬浮沉淀，冰浴30 min。于4以6,000 rpm 离心10 min回收细胞，在冰浴中用2 mL冰冷的0.1 mol/L CaCl2悬浮细胞备用，然后分装于预冷的无菌管中，立即冻于-70 ；5从-70 取出感受态细胞悬浮液，室温下使其解冻后立即置于冰上。向大肠杆菌感受态细胞悬浮液中加入1020 L DNA连接产物（或12 L质粒）溶液，用手指轻轻弹几下后放冰水浴30 min；6转入42 水浴90 s(进行热休克)；7再迅速置于冰水浴12 min；8加入500 L LB(不含抗生素)培养基后，37 保温4550 min；9将转化菌液涂布于含100 g/mL氨苄青霉素的LB培养基平皿上。正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后将培养皿倒置，37 培养1624 h；10挑选阳性克隆菌落，用于提取阳性克隆菌的质粒。注意：制备感受态细胞的全部过程均需于冰上操作，同时注意近火无菌操作，防止感受态细胞受杂菌污染；42 热处理时很关键，转移速度要快，且温度要准确；菌液涂皿操作时应避免反复来回涂布，因为感受态细胞的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂影响转化率。2.2.6.7大肠杆菌质粒DNA的提取（参照质粒小量快速提取试剂盒提取）1收菌：取15 mL过夜培养的大肠杆菌菌液，13000 rpm（17900g）离心1 min，弃上清（注意：一般高拷贝质粒用24 mL菌液，低拷贝质粒用510 mL菌液，若使用大体积菌液，相应加大各溶液的体积）；2重悬菌液：将250 L Resuspension Buffer（已加RNase A）加入菌液沉淀，Vortex充分悬浮细菌沉淀（注意：请充分重悬细胞，若不充分会导致碱裂解不完成）；3碱裂解