细菌的简单染色和革兰染色.doc

生76 王韬 2007030053细菌的简单染色和革兰染色姓名：王韬班级：生76组号：7-2组同组人：袁堂谧实验日期：2009-10-23一、 实验目的：1. 掌握细菌涂片的制作。2. 掌握细菌简单染色和革兰氏染色的原理和操作方法，了解影响染色结果的关键因素。3. 学习无菌操作技术。二、 实验原理：1. 简单染色：由于细菌时常带负电荷，可以使用带正电的碱性染料使其着色。当细菌分解糖类物质产生酸时，细菌带正电荷增加，就可以被带负电的酸性染料使其着色。常用碱性染料有美蓝、甲紫、碱性复红火孔雀绿等，酸性染料有伊红、酸性复红或刚果红等。2. 革兰氏染色：简单染色就是用染色剂使细菌着色以显示其形态，没有特异性。而革兰氏染色可以将细菌区分为两种不同的种类，即革兰氏阳性和阴性。革兰氏阴性菌的细胞壁含有大量脂类物质，容易被乙醇、丙酮等有机溶剂溶解，致使细胞壁通透性增强。而阳性菌细胞壁通透性不受有机溶剂影响。以此原理，通过初染、媒染、脱色和复染就可以使两种细菌呈现不同的颜色。三、 实验材料：1. 菌种：大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌和待测未知菌的18小时液体培养液。酵母菌平板和牙垢。2. 用具：显微镜，镜油，擦镜纸，擦镜油，酒精灯，接种环，无菌牙签，载玻片和盖玻片。3. 简单染液：甲基紫染液。4. 革兰氏染液：甲基紫染液，碘液，95%乙醇溶液，蕃红染液。四、 实验步骤：1. 涂片：清洗干净载玻片，在其背面用标记笔画一个直径5mm左右的圆，即为涂片区域。在酒精灯火焰附近，用灼烧过的接种环蘸取少量菌液，均匀地涂在载玻片上。若为固体菌种（或牙垢），可以先在载玻片上滴加半滴水。用接种针（牙签）在菌落（牙齿）上擦一下，然后浸入水中，将水滴涂匀。接种结束后灼烧接种环以备下次使用。2. 干燥：常温下自然干燥。3. 固定：本实验使用高温快速固定。将已干燥的载玻片背面在火焰上快速通过2至3次，载玻片温度不超过60，时间3-4秒。4. 染色：1) 初染：向标本上滴加甲基紫染液，染色1min，水洗，吸干。（此步结束即为简单染色，可以进行镜检。）2) 媒染：向标本上滴加碘液，染色1min，水洗，吸干。3) 脱色：向标本上滴加95%乙醇溶液，轻轻摇动载玻片直至流出的乙醇无紫色为止。脱色时间一般为20-30s。脱色完立即水洗，吸干。4) 复染：向标本上滴加蕃红染液，染色2-3min，水洗。（此步结束即为革兰氏染色，可以进行镜检）5. 镜检：吸干载玻片背面和标本周围的水渍，在样本上滴加少量水，盖上盖玻片，从低倍镜到油镜依次观察标本。观察时注意标本中细菌的形态、大小、排列和颜色。区分革兰氏阳性和阴性菌。五、 实验结果：图1. 金黄色葡萄球菌 10100图2. 未知菌 10100图3. 牙垢微生物 10100图4. 大肠杆菌 10100图5. 酵母菌 10100图6. 枯草杆菌 10100实验结果说明：1. 金黄色葡萄球菌（如图1示）：球状，单个、两个或四个细菌分布。革兰氏染色为紫色，故为革兰氏阳性菌。由于细胞较分散，且个体小，所以看起来颜色为黑色，实际为深紫色。2. 未知菌（如图2示）：球状，聚集分布，细胞较小。革兰氏染色为红色，故为革兰氏阴性菌。3. 牙垢微生物（如图3示）：主要是球状的染成紫色的细菌，为革兰氏阳性菌。背景中的很多红色物质，并不具有细胞结构，疑为杂质。4. 大肠杆菌（如图4示）：杆状，个体小，单个或两个细菌分布。革兰氏染色为红色，故为革兰氏阴性菌。5. 酵母菌（如图5示）：椭球状，个体较大。芽为圆形，较小。深紫色，呈革兰氏阳性反应，因为酵母菌细胞壁脂类含量少，这和革兰氏阳性菌是一致的。6. 枯草杆菌（如图6示）：杆状，个体较小。部分细胞排列成链状。未观察到芽孢。革兰氏染色为紫色，故为革兰氏阳性菌。六、 实验结果讨论：1. 从上面几幅图中可以看出，金黄色葡萄球菌、酵母菌和未知菌的制作和染色是很成功的。这几张涂片细菌分布均匀，颜色效果明显，可以很容易区分出阳性阴性。另外细胞形态结构也很容易辨认。2. 牙垢微生物涂片的制作不是很好，因为可以明显看出被染成红色的部分并非微生物，因为没有细胞结构，这些都是口腔杂质。这是因为在制作时没有对杂质进行处理。肉眼可见的杂志均未除去。受杂质的影响，微生物的分布就不均匀了。但是，被染成紫色的球状微生物还是可以辨认出来的。一般情况下，在一个视野里只能看到一种微生物。对牙垢涂片进行仔细观察后，发现至少有两种微生物。这些微生物可以通过染色程度和细胞形态、大小和排列来辨认。3. 由于大肠杆菌在固定时对温度比较敏感。过高可能造成细胞的严重损伤，染色效果不好。过低则不能很好地粘附在载玻片上。大肠杆菌是阴性菌，理论上颜色应该为红色。但是又两个过程可能影响染色。一个是脱色过程，大肠杆菌对脱色时间比较敏感，过长会造成细胞膜的破裂，无法继续染色。过短脱色就不完全，紫色的甲基紫-碘复合体会影响蕃红的染色效果。另外一个是蕃红的染色时间，蕃红的染色时间可以适当加长。所以制作大肠杆菌涂片的技术要求比较高。实验的多个环节均可以对结果造成很大的影响。4. 枯草杆菌的颜色比较浅，但是还是足够辨认为紫色。枯草杆菌是我们制作的第一张涂片，所以在染色时间和固定时间的控制上把握并不是太好。太浅的主要原因有可能是初染和复染的时间过短。5. 实验证明，酵母菌虽然是真菌，但是还是可以通过革兰氏染色方法着色的。所染颜色为紫色。原因是酵母菌的细胞壁成分比较特殊,它呈三明治状:外层为甘露糖,中间是一层蛋白质(包括多种酶),内层是葡聚糖。脂类的含量很少。对于革兰氏染色原理来说，它和革兰氏阳性菌细胞壁相似。故染色结果为阳性。6. 综上所述，影响革兰氏染色结果的因素有：1) 操作是否