实验两对半的检测ppt课件.ppt

ELISA检测 乙肝二对半 EnzymelinkedimmunosorbentAssayELISA 1 酶免疫技术分类 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定 均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定 2 ELISA的概念 酶联免疫吸附试验 enzyme linkedimmunosorbentassay ELISA 酶联 抗原或抗体的酶标记 免疫 以抗原抗体特异性反应为基础 吸附 抗原或抗体包被于固相载体表面 在固相载体表面实现抗原抗体的反应 通过酶标记的手段 酶催化底物形成水解 氧化或还原反应 形成有色物质 其颜色的深浅与标本中的抗原或抗体的量直接相关 3 ELISA技术特点 具有良好的灵敏度和特异性 能满足临床需要 应用广泛 操作简单 无需昂贵的仪器投入 价格便宜 对环境几乎没有污染 4 ELISA技术的应用 检测抗原的方法 双抗体夹心法竞争法 检测抗体的方法 双抗原夹心法间接法竞争法捕获法 5 实验目的 掌握ELISA法检测 乙肝二对半 的原理 操作步骤及注意事项 掌握检测 乙肝二对半 的临床意义 6 什么是 乙肝二对半 乙肝两对半 是指 表面抗原 HBsAg 表面抗体 HBsAb e抗原 HBeAg e抗体 HBeAb 核心抗体 HBcAb HBsAg本身不具有传染性 只具有抗原性保护性抗体 HBsAb传染性指标 HBeAg HBcAgHBeAb HBcAb不是保护性抗体 而是反映曾被HBV感染的重要指标 7 为什么不检测核心抗原 HBcAg HBcAg主要位于病毒颗粒中 只有少数游离 机体免疫系统对HBcAg很敏感 易产生高滴度的HBcAb 与HBcAg形成免疫复合物 血清中 HBcAg可丢失部分氨基酸 8 乙肝二对半 的检测原理 HBsAg 双抗体夹心法HBsAb 双抗原夹心法HBeAg 双抗体夹心法HBeAb 中和竞争法 血清中的e抗体与固相e抗体竞争结合e抗原 HBcAb 竞争抑制法 9 双抗原 体 夹心法测抗体 原 Anti HIV Anti HBs 双抗体夹心法 双抗原夹心法 HBsAg HCVcoreAg HBeAg HBVpreS1 PreS2 10 双抗体夹心法测抗原 Y Y E Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 11 竞争抑制法测抗体 包被抗原 Anti HBcAnti HBe 12 中和竞争法测抗体 Anti HBe 13 试剂盒组成 包被反应板 固相的抗原或抗体酶结合物 酶标记的抗原或抗体显色剂 分A B二瓶终止液对照 阳性对照 阴性对照浓缩洗涤液中和试剂 只有检测HBeAb的试剂盒才有 14 实验准备 配制洗涤液 用蒸馏水按1 20稀释浓缩洗涤液 为节省试验时间 除检测核心抗体 HBcAb 组外 其余组可在加样后的温育时间中才配制洗涤液 15 实验操作 1 加样 第一 二孔为阴 阳对照孔 分别加入阴 阳对照50ul 其余各孔为样品孔 各加入待测标本50ul 检测HBcAb时 待测标本需用稀释后的洗涤液做1 30稀释 2 加中和试剂 只有检测HBeAb时才需要 每孔50ul3 加酶结合物 每孔50ul4 温育 封板 充分混匀后置37 C水浴30分钟5 洗涤 弃去反应条孔内液体 用洗涤液注満每孔 放置或振荡1分钟 弃去拍干 反复5次 注意 最后一次一定要拍干 6 显色 每孔先加显色剂A50ul 再加显色剂B50ul 混匀后置37 C水浴10分钟7 中止显色 每孔加入中止液50ul8 判断结果 16 目测法 HBsAg HBsAb HBeAg 17 HBeAb HBcAb 18 比色法 波长450nm读取各孔OD值HBsAg HBsAb HBeAg样品OD值 阴性对照OD值 2 1HBeAb HBcAb阴性对照OD值 样品OD值 2 1 建议双波长比色 450 630nm 临界值的确定请参考实验指导 不同的试剂盒和检测原理 临界值的设定均不同 阳性 阳性 19 ELISA的注意事项 标本 内源性 RF 补体 嗜异性抗体等 外源性因素 溶血 细菌污染 保存不当 凝集不全 防腐剂NaN3等 P229 试剂 试剂质量 批号 是否失效 冰箱温度 平衡 37度 C30分钟 摇匀加样 加样准确 不可太快 避免加在上部和产生气泡 温育 温度 定期观察与登记 时间 湿度 封片 不可重复用 洗板 洗涤液用蒸馏水或去离子水现配 防止洗板机堵塞 洗完要拍板 显色 加试剂时不可重复加和漏加 或加在两孔之间 不要产生气泡 及时终止 比色 建议用双波长 可排除标本浓度 干扰色 电路干扰 板底部划痕的影响 结果判定 反应终止后10分钟内质量控制 内对照 室内质控 室间质评等 全程质控意识 表面抗原阳性结果 灰区标本 矛盾结果或少见模式均须复查生物安全 试剂盒应视为有传染性物质 请按传染病实验室检查规程