酿酒酵母工业菌株胁迫条件耐受性分析.pdf

2 0 0 6N o 1 S e r i a l N o 1 5 4 C h i n aB r e w i n g R e s e a r c h R e p o r t 对微生物特别是工业生产用菌株基本性状的了 解 是对其进行遗传学及分子生物学改造的基础 酿 酒酵母是传统的工业生产菌株 具有生长旺盛 生物 量大 简单廉价 公认安全性菌株等优良特点 广泛 用于食品 医药及化工等发酵工业中 酿酒酵母在工 业发酵过程中不可避免地受到胁迫条件 如酒精毒 性 高温胁迫等 的影响 1 4 其对这些胁迫条件的耐 受性直接关系到工艺 设备的确定 进而影响经济效 益 提高菌株对胁迫条件的耐受性是酿酒酵母工业菌 株改良的重要目标之一 同时酿酒酵母工业菌株的分 收稿日期 2 0 0 5 0 8 0 5 基金项目 国家自然科学基金委员会与中国节能投资公司联合研究基金资助项目 5 0 2 7 3 0 1 9 作者简介 刘向勇 1 9 8 1 男 山东滨州人 在读硕士研究生 鲍晓明 教授 通讯作者 主要研究微生物遗传与 分子生物学 酿酒酵母工业菌株胁迫条件耐受性分析 刘向勇 张小华 鲍晓明 山东大学 微生物技术国家重点实验室 山东 济南2 5 0 1 0 0 摘要 对酿酒酵母 S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e 工业菌株胁迫条件 包括高浓度酒精 高渗透压 高温 营养饥饿 氧化 胁迫 糠醛毒性的耐受性进行了分析 同时测定了抗生素 G 4 1 8 对这些菌株的最低抑菌浓度 结果表明 所测定的酵母菌株 对这些逆境条件的耐受性有明显差别 表现出良好耐受性的是 6 5 0 8 和安琪酵母菌株 同时多倍性的酿酒酵母工业菌株的耐 受性均比单倍性实验室菌株高 关键词 耐受性 酿酒酵母 发酵 中图分类号 T S 2 6 1 1文献标识码 B文章编号 0 2 5 4 5 0 7 1 2 0 0 6 0 1 0 0 0 8 0 4 菌株遗传性状和特征来源 S c e r e v i s i a e H 1 5 8n e u 2 2 3 l e u 2 2 1 1 2 u r a 3 2 5 2 t r p 1 2 2 8 9 h i s 4 2 5 1 9 p r b 1 c i r 本实验室保存 W3 0 3 1 An MA T a l e u 2 3 1 1 2 u r a 3 1 t r p 1 6 1 h i s 3 1 1 1 5 a d e 2 1 c a n 1 1 0 0 G A LS U C2 m a l 0本实验室保存 N A N 2 72 n酒精生产酿酒酵母工业菌株河南天冠企业集团 南阳 5 2 n酒精生产酿酒酵母工业菌株河南天冠企业集团 1 3 0 02 n酒精生产酿酒酵母工业菌株河南天冠企业集团 1 3 0 82 n酒精生产酿酒酵母工业菌株河南天冠企业集团 6 5 0 82 n酒精生产酿酒酵母工业菌株大连理工大学 安琪 表1实验用菌株 T a b l e1 Y e a s t s t r a i n su s e di nt h ee x p e r i me n t S t u d y o n t h e s t r e s s r e s i s t a n c e o f S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e i n d u s t r i a l s t r a i n s L I UX i a n g y o n g Z H A N GX i a o h u a B A OX i a o m i n g S t a t e K e y L a b o r a t o r y o f Mi c r o b i a l T e c h n o l o g y S h a n d o n g U n i v e r s i t y J i n a n 2 5 0 1 0 0 C h i n a A b s t r a c t T h es t r e s sr e s i s t a n c eo f S a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ei n d u s t r i a l s t r a i n st oh i g h c o n c e n t r a t i o ne t h a n o l h i g ho s m o t i cp r e s s u r e h i g h t e m p e r a t u r e n u t r i e n t s t a r v a t i o n o x i d a t i v e s t r e s s f u r f u r a l t o x i c i t y a n dt h e s e n s i t i v i t y t oG 4 1 8w e r e a n a l y z e di nt h i s p a p e r T h e r e s u l t s h o w e d t h a t t h e s t r e s s r e s i s t a n c e s a m o n g t h e s e y e a s t s t r a i n s w e r e o b v i o u s l y d i f f e r e n t T h e s t r a i n s 6 5 0 8 a n d A n g e l a r e t h e m o s t r e s i s t a n t T h e p o l y p l o i d y i n d u s t r i a l s t r a i n s w e r e m o r e r e s i s t a n t t o s t r e s s c o n d i t i o n s t h a n t h a t o f t h e h a p l o i d l a b o r a t o r y s t r a i n s K e y w o r d s s t r e s s r e s i s t a n c e S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e f e r m e n t a t i o n 8 2 0 0 6 年 第 1 期 总第 1 5 4 期 中国酿造 研究报告 子生物操作体系本身的特点 5 也需要了解其对某些 抗菌因子的敏感性 本文对酿酒酵母工业菌株 进行 了胁迫条件耐受性分析 为这些菌株进行分子生物学 改造提供了有价值的参考 1材料与方法 1 1菌株 实验用酿酒酵母菌株见表 1 1 2培养基 酵母 Y P D培养基 酵母提取粉 1 蛋白胨 2 及葡萄糖 2 p H 6 0 0 2 1 1 5 灭菌 2 0 m i n 1 3酵母耐受性测定 酵母各项耐受性的测定是根据菌株在含有不同抑 制物的 Y P D固体平板培养基上的生长状况测定的 测 定方法为梯度生长实验 接种酵母于 2 0 m L的 Y P D液 体培养基中 3 0 过夜培养 A6 0 0 0 8 离心收集菌 体 制备休止细胞 调节菌液浓度为 A6 0 0 1 0 1 0 倍 梯度稀释 依次取 4 L点滴于测试平板 3 0 培养 2 d 4 d 观察菌落生长情况 1 3 1酒精耐受性测定 在含 8 和 1 0 v v 乙醇的 Y P D固体平板进 行梯度生长实验 以生长状况表征其酒精耐受性 1 3 2渗透胁迫耐受性测定 在含 0 7 m o l L和 1 0 m o l LK C l 的 Y P D固体平板进 行梯度生长实验 以生长状况表征其渗透胁迫耐受性 1 3 3高温耐受性测定 在 3 7 和 4 2 下 Y P D固体平板培养进行梯度 生长实验 以生长状况表征其高温耐受性 1 3 4糠醛耐受性测定 在含 0 7 g L和 1 0 g L糠醛的 Y P D固体平板培养 基进行梯度生长实验 以生长状况表征其糠醛耐受性 1 3 5营养饥饿耐受性测定 将各菌株的休止细胞在无菌水中 3 0 摇瓶培养 4 8 h 在 Y P D固体平板培养基进行梯度生长实验 以 生长状况表征其营养饥饿耐受性 1 3 6氧化胁迫耐受性测定 参照 S t e p h e n D W S 6 方法并加以改进 采用培养 基混菌法 将 1 0 0 LA6 0 0 2 0菌液与 1 5 m L冷却至 5 0 左右的 Y P D固体培养基混匀 将灭菌的直径 0 5 m m滤纸片放于平板中央 加 6 L 3 0 H2O2滤纸片上 3 0 培养2 d 以抑菌圈直径表征其氧化胁迫耐受性 1 3 7G 4 1 8最低抑菌浓度的测定 将酵母菌过夜培养 收集菌体 制备休止细胞 适当稀释后涂布含不同浓度梯度 G 4 1 8 的平板 3 0 培养 3 d 4 d 观察生长情况 2结果与讨论 2 1酵母高浓度酒精和高渗透胁迫耐受性测定 酿酒酵母对高浓度酒精和高渗透胁迫的耐受性是 发酵工业特别是酒精生产中的重要特性 酿酒酵母对 高渗透胁迫和高浓度酒精的强耐受性可以显著降低后 续酒精精馏操作的能耗 提高设备利用率和酒精产 量 可以进一步提高生产效率和经济效益 7 酒精对 细胞的抑制作用很复杂 主要表现在抑制细胞生长 细胞存活性和发酵力 3 个方面 2 利用梯度生长测定 各菌株在 8 和 1 0 v v 酒精平板上的生长状况见 图 1 A 图 1 A 显示各被测菌株间酒精耐受性 差异较大 其中 1 3 0 8 和南阳 5 酒精耐受性相对较弱 在高浓度酒精平板上 表现出明显的弱势生长 同时 二倍性的工业酵母菌株均比单倍性的实验室菌株 W3 0 3 1 A H 1 5 8 表现出较高的酒精耐受性 高渗透胁迫主要发生在发酵初期 酒精的浓醪 发酵工艺初始葡萄糖的浓度 3 0 左右 高浓度的葡萄 糖的渗透压对菌体的生长有很大的负面影响 因此要 求酿酒酵母菌株具有较高的高渗透耐受性 利用梯度 生长测定各菌株在 0 7 m o l L和 1 0 m o l LK C l 水活度 分别为 0 9 7 7和 0 9 6 7 8 平板上的生长状况见图 1 图 1 显示多数被测菌株对低水分活度的条件呈现出敏 感性 但安琪酵母表现出较高的渗透胁迫耐受性 2 2酵母温度耐受性测定 采用高温度发酵工艺可以减少冷却能耗 提高代 谢率 缩短发酵周期 3 选育优良的耐高温菌株是实 现该工艺的前提 利用梯度生长测定各菌株在 3 7 和 4 2 下的生长状况见图 1 B 图 1 B 显示各被测 菌株均表现出较好的高温耐受性 3 7 对各菌株的生 长无明显抑制作用 温度达到 4 2 时除 W3 0 3 呈现热 敏感性 其它菌株仍可良好生长 2 3酵母糠醛耐受性测定 通过途径工程理念 对酿酒酵母代谢途径进行理 性设计 使其具有共发酵葡萄糖和木糖产生酒精的能 力 提高酒精得率 是当前转化木质纤维素生产燃料 酒精的研究热点之一 9 1 0 但是木质纤维材料经预处理 后会产生大量的毒性物质 如 呋喃的衍生物糖醛 等 这些毒性物质对酿酒酵母的生长有抑制作用 利 用梯度生长测定各菌株在含 0 7g L和 1 0 g L糠醛平 板的生长状况见图 1 B 图 1 B 显示 培养基中 糠醛浓度达到 1 0 g L时对各被测菌株均有较强的抑制 作用 根据 L A R S S O NS 1 1 的报道 云杉木质纤维素 9 2 0 0 6N o 1 S e r i a l N o 1 5 4 C h i n aB r e w i n g 水解物中糠醛的含量为 1 4 g L 但是本实验结果显 示 在这一糠醛浓度下所有被测菌株均不能生长 结 果未显示 因此提高酿酒酵母对糠醛的耐受性 是 实现木质纤维素酒精发酵的基础之一 2 4营养饥饿耐受性测定 随着发酵过程的进行 营养物质的消耗会影响微 生物发酵能力 酿酒酵母对营养饥饿耐受性好是发酵 工艺特别是连续发酵工艺所要求的良好性质 一般 地 营养饥饿胁迫主要发生在发酵后期 各测试菌株 经 4 8 h 无营养 无菌水中 的处理后的生长状态见图 1 B 图 1 B 显 示 除 实 验 室 菌 株 H 1 5 8 W3 0 3 1 A外 各菌株均表现出较好的营养饥饿耐受性 2 5氧化胁迫耐受性测定 氧化胁迫也是发酵工业中常见的胁迫条件 1 2 1 3 因此发酵菌株要具备一定的抗氧化胁迫能力 以 H2O2 作为氧化胁迫因子 通过各测试菌株抑菌圈直径 表 征菌株抗氧化胁迫能力 H2O2对菌株产生的抑菌圈 小 表明该菌有较好的氧化胁迫耐受性 各测试菌株 产生的抑菌圈及抑菌圈直径见图 2 图 2 结果表明 工业菌株 6 5 0 8 抑菌圈最小 直 径 2 8 c m 氧化胁迫耐受性最强 而实验室菌株 H 1 5 8 抗氧化能力最弱 抑菌圈直径 3 8 c m 2 6G 4 1 8最低抑菌浓度的测定 显性标记是实现对酿酒酵母工业菌株分子生物学 改造基因操作的基础 G 4 1 8 抗性基因是近几年发展 起来的用于酵母转化系统的方便实用的显性标记 1 4 但不同的菌株对 G 4 1 8 的敏感性不同 因此必须首先 确定 G 4 1 8 对各受体菌株的最低抑菌浓度 G 4 1 8 对各 测试菌株的最低抑菌浓度果见表 2 表2G 4 1 8对酵母菌的最低抑菌浓度 T a b l e2 S e n s i b i l i t yo f y e a s t s t r a i n st oG 4 1 8 菌株G 4 1 8 最低抑菌浓度 g m L 1 S c e r e v i s i a eH 1 5 81 0 0 W3 0 3 1 A4 0 0 N A N 2 74 0 0 南阳 5 2 0 0 1 3 0 02 0 0 1 3 0 83 0 0 6 5 0 82 0 0 安琪6 0 0 A6 0 01 0 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3 Y P D3 7 Y P D 4 2 Y P D 糠醛 0 7 g LY P D 糠醛 1 0 g L4 8 h 营养饥饿 R e s e a r c h R e p o r t A6 0 01 0 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3 w 3 0 3 H 1 5 8 南阳 5 N A N 2 7 1 3 0 0 1 3 0 8 6 5 0 8 安琪 Y P D3 0 对照 Y P D 乙醇 8 v v Y P D 乙醇 1 0 v v Y P D 0 7 m o l LK C lY P D 1 0 m o l LK C l 图1各菌株对酒精 渗透压 高温 营养饥饿 氧化胁迫 糠醛毒性抗性测定结果 F ig u r e1 S t r e s sr e s is t a n c eo f y e a s t s t r a in st oe t h a n o l o s m o t icp r e s s u r e h ig ht e m p e r a t u r e n u t r ie n t s t a r v a t io n o x id a t io na n df u r f u r a l t o x ic it y w 3 0 3 H 1 5 8 南阳 5 N A N 2 7 1 3 0 0 1 3 0 8 6 5 0 8 安琪 1 0 2 0 0 6 年 第 1 期 总第 1 5 4 期 中国酿造 中 国 酿 造 合 订 本 含 邮 费 1 9 9 6年5 0元 2 0 0 2年1 0 0元 2 0 0 4年1 6 0元 表 2 结果显示 由于菌株间生理生化特性 遗传 特性的差异 G 4 1 8 对不同菌株的最低抑菌浓度差别 较大 因此针对不同酵母菌株 需要建立不同的酿酒 酵母转化体系 图2各菌株氧化胁迫抗性测定结果 F i g u r e2 O x i d a t i v es t r e s sr e s i s t a n c eo f y e a s t s t r a i n s 表3不同酵母菌株间耐受性比较 T a b l e3 C o mp a r i s o no ft h es t r e s sr e s i s t a n c e sa mo n g d i f f e r e n t y e a s t s t r a i n s 综上所述 不同酵母菌株对这些胁迫条件的耐受 性有很大差异 表 3 为有针对性地选育和分子改造 这些菌株提供了依据 本文报道的胁迫条件耐受性测 定体系方法简单易行 对设备仪器要求低 能很好的 满足实验要求 同时建立从耐受性强弱角度出发的菌 株筛选体系对于其它微生物发酵工业如淀粉 饲料等 发酵菌株的选育也具有普遍意义 目前对于酵母耐受 性与其发酵力 以及各耐受性间的相互关系已有相关 报道 1 5 同时开展酵母抗逆机制的研究对阐明生命活 动机制和最终通过基因工程手段提高菌株的抗逆性具 有重要的意义 参考文献 1 A T T F I E L DPV S t r e s s t o l e r a n c e t h e k e y t o e f f e c t i v e s t r a i n s o f i n d u s t r i a l b a k e r s y e a s t J N a t B i o t e c h n o l 1 9 9 7 1 5 1 3 1 3 5 1 1 3 5 7 2 王滨 张国政 路福平 等 酵母酒精耐性机制的研究 进展 J 天津轻工业学院学报 2 0 0 1 1 1 8 2 2 3 李洪刚 耐高温活性鲜酵母在酒精发酵生产上的应用 J 酿 酒科技 1 9 9 4 4 4 4 4 5 4 梅丛笑 方元超 王福荣 啤酒酵母的改良途径 J 食品工 业科技 2 0 0 0 3 7 0 7 2 5 王颖 鲍晓明 杨国梁 等 工业酵母菌株转化体系的建 立 J 工业微生物 2 0 0 4 3 4 1 6 1 1 6 S T E P H E NDW S R I V E R SSL J A MI E S O NDJ T h e r o l e o f Y A P 1 a n d Y A P 2 g e n e s i n t h e r e g u l a t i o n o f t h e a d a p t a t i v e o x i d a t i v e s t r e s s r e s p o n s e s o f S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e J Mo l Mi c r o b i o l 1 9 9 5 1 6 4 1 5 4 2 3 7 秦成国 玉米粉高浓度酒精发酵的研究 J 酿酒科技 1 9 9 7 4 5 2 5 4 8 C H E NCS Wa t e r a c t i v i t y c o n c e n t r a t i o n m o d e l s f o r s o l u t i o n s o f s u g a r s s a l t s a n d a c i d s J J o u r n a l o f F o o dS c i e n c e 1 9 8 9 5 4 1 3 1 8 1 3 2 1 9 S O N D E R E G G E RM J E P P S S O NM L A R S S O NC e t a l F e r m e n t a t i o n p e r f o r m a n c e o f e n g i n e e r e d a n d e v o l v e d x y l o s e f e r m e n t i n g S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a s t r a i n s J B i o t e c h n o l B i o e n g 2 0 0 4 8 7 1 9 0 9 8 1 0 沈煜 王颖 鲍晓明 等 酿酒酵母木糖发酵酒精途径 工程的研究进展 J 生物工程学报 2 0 0 3 1 9 5 6 3 6 6 4 0 1 1 L A R S S O NS C A S S L A N DP J O N S S O NLJ D e v e l o p m e n t o f a S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i as t r a i nw i t he n h a n c e d r e s i s t a n c e t o p h e n o l i c f e r m e n t a t i o n i n h i b i t o r s i n l i g n o c e l l u l o s e h y d r o l y s a t e s b y h