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生物技术概论实验指导书张军科 陈书霞 王西平本课程共40学时，其中实验12学时。实验一：植物基因组DNA提取(综合性实验) 必开 3学时实验二：大肠杆菌质粒DNA提取(综合性实验) 必开 3学时实验三：核酸(DNA)电泳(综合性实验) 必开 3学时实验四：聚合酶链式反应(PCR)(综合性实验) 必开 3学时实验五：农杆菌介导植物叶盘转化(综合性实验) 选开 6学时实验一 植物基因组DNA的提取(综合实验,必开)新鲜材料小量CTAB提取法(3学时)基因组DNA的提取通常用于PCR分离基因、构建基因组文库、Southern杂交等。不同生物的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。本实验以蔬菜(菠菜)、果树(苹果)、花卉(菊花)为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。一、目的和要求(一)目的：1、掌握植物基因组DNA提取原理。2、学习植物基因组DNA提取的方法。(二)要求1、材料准备分4-6组进行，提取过程独立进行，每人提取2份(管)。2、在3小时内完成，提取产物按本人在本班学号编号(如10a、10b)并上交。3、完成实验报告1份。二、原理强离子去污剂CTAB可以破坏植物细胞膜，使植物细胞内容物释放出来，蛋白质等有机物质可通过变性和有机溶剂抽提去除，植物DNA可溶于高浓度CTAB而在低浓度是沉淀，从而可将核酸分离。三、材料、仪器和试剂(一)、材料：果树蔬菜花卉叶片每人1片或枝条每人1支。(二)、仪器1、1000ul移液器：57支2、1000ul枪头盒：57个3、200ul移液器：4-6支4、200ul枪头盒：4-6个5、2 0ul移液器：1支6、2 0ul枪头盒：1个7、台式高速离心机：24台8、水浴锅：24台9、陶瓷研钵：46套10、1.5ml离心管：每人610个11、不锈钢药勺：46个12、剪刀：46把13、架盘天平：24台14、塑料离心管架1.5ml：46个15、不锈钢离心管架1.5ml：1-2个16、通风厨：12个17、涡旋混合仪：24个18、标签纸：46张19、保温壶：46个20、不锈钢汤勺：46个21、液氮罐30L：1个 (三)、试剂1、需要化学试剂TrisHClEDTAPVPNaCl95%乙醇：1L无菌水：10L巯基乙醇：100ml氯仿：500 ml异戊醇：500mlRnase：1支无菌水：10L液氮：30L2、母液准备：共1份1mol/L Tris-Cl H8.0缓冲液：1L500mmol/L EDTA pH8.0：500ml。配制方法(100ml)：二水乙二铵四乙酸二钠18.61 g，灭菌双蒸水80 mL，氢氧化钠调pH至8.0，灭菌双蒸水定容至100 mL。6mol/L NaCl：1L10% PVP：500ml3、提取试剂准备(每组1份)：液氮：提取缓冲液：提取缓冲液中含100mmol/L TrisCl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 1.5M NaCl, 2%PVP。95%乙醇75%乙醇TERnaseA巯基乙醇(每班1份，置通风橱中)氯仿:异戊醇(24:1) (每班1份，置通风橱中)四、操作步骤1. 打开水浴锅，设定温度为65C，将提取缓冲液放入其中预热至65C。2. 每小组从液氮罐中取液氮放入保温壶备用，并准备好汤勺、研钵、药勺备用。3. 称取用提取材料(每人约0.40.5g)，用剪刀迅速剪成0.5cm2碎片放入研钵中。4. 迅速加入液氮研磨成白色粉末(注意：研磨期间必须加入液氮23次，保持材料的冻结状态)。5. 每人取2个离心管，每管迅速加入研磨后的材料0.1g(1.5ml离心管的0.3刻度左右，注意操作要快，尽量保持材料的冷冻状态)。6. 每管加提取缓冲液600ul。7. 在通风橱中加入-巯基乙醇12ul。8. 颠倒离心管摇匀后65C水浴30min，期间轻柔混匀2-3次。9. 取出自然冷却至室温后，加241的氯仿：异戊醇600ul ，在涡旋混合仪上混匀1min。10. 12000rpm离心10min.，轻柔取出离心管，不要晃动。此时离心管中会分为上下两相，下层为有机相，上层为水相，DNA存在于水相中。 11. 用移液器小心缓慢吸取上层上清液约500ul，不要吸取浑浊中间相，加入241的氯仿：异戊醇500ul ，在涡旋混合仪上混匀1min。12. 12000rpm离心7min.，轻柔取出离心管，不要晃动。此时离心管中会分为上下两相，下层为有机相，上层为水相，DNA存在于水相中。13. 用移液器小心缓慢吸取上层上清液约400ul，不要吸取浑浊中间相，加入800ul无水乙醇，室温静置10min.14. 12000rpm离心7min.，小心倒除上清液，保留絮状沉淀，并用70的乙醇冲洗2次(如沉淀分散可重复本次离心步骤)。15. 倒立离心管1min，水平放置离心管至管内完全干燥至沉淀透明。16. 每管加入40ulTE和0.5ul RNase(1u/ul) 4C溶解DNA过夜。17. 20C保存备用。五、结果与分析植物基因组DNA分子应为线状分子，溶解后为透明溶液，沉淀时为透明至白色，因此，本次实验中，在DNA沉淀干燥后，应能看到白色沉淀，如果看不到白色沉淀，说明提取失败。主要原因有：加入无水乙醇后沉淀时间不够；75%乙醇漂洗时DNA沉淀随乙醇被弃去。提取的DNA的浓度、质量将在实验三中通过电泳进行定性、定量分析。实验二：大肠杆菌质粒DNA提取(综合实验，必开)碱变性小量法(3学时)细菌质粒DNA是基因工程中的最常用的载体，因此提取细菌质粒DNA是基因工程中构建克隆载体、重组子筛选的常规操作，学习提取质粒的方法和原理是生物技术课程的基本要求之一。一、目的和要求(一)目的：1、掌握细菌质粒DNA提取原理。2、学习微生物质粒DNA提取的方法。(二)要求1、材料准备分4-6组进行，提取过程独立进行，每人提取2份(管)。2、在3小时内完成，提取产物按本人在本班学号编号(如10a、10b)并上交。3、完成实验报告1份。二、原理变性条件下，DNA、蛋白质等变性后会沉淀，分子量较大的线状基因组DNA和分子量较小的环状质粒DNA在变性后复性时，环状小分子质粒DNA复性速度较快，从而可以将质粒DNA加以分离。可溶性DNA可以用乙醇或异丙醇沉淀。三、材料、仪器和试剂(一)、材料：含有质粒的经37200rpm振荡过夜悬浮培养的大肠杆菌培养液每人5ml。(二)、仪器1、1000ul移液器：57支2、1000ul枪头盒：57个3、200ul移液器：4-6支4、200ul枪头盒：4-6个5、台式高速离心机：24台6、冰浴或冰盘：24个7、1.5ml离心管：每人610个8、架盘天平：24台9、塑料离心管架1.5ml：46个10、不锈钢离心管架1.5ml：1-2个11、通风厨：12个12、涡旋混合仪：24个13、标签纸：46张(三)、试剂1、需要化学试剂葡萄糖TrisHClEDTANaOHSDS异丙醇36%冰醋酸醋酸钠无水乙醇95%乙醇氯仿：500 ml异戊醇：500mlRnase：1支无菌水：10L2、母液准备：共1份1mol/L Tris-Cl H8.0缓冲液：1L500mmol/L EDTA pH8.0：500ml6mol/L NaCl：1L10% PVP：500ml3、提取试剂准备(每组1份)：GTE(溶液：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L TrisCl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)10% NaOH10% SDSKAC-AC: (溶液：5mol/乙酸钾 60ml，冰乙酸 11.5ml，水 28.5ml，所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。)无水乙醇75%乙醇TERnaseA氯仿:异戊醇(24:1) (每班1份，置通风橱中)四、操作步骤1. 含有质粒的细菌37200rpm过夜悬浮振荡培养(实验前12天完成)。2. 将1.2ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4以12000g离心30秒，收集沉淀，弃去上清液。3. 重复上步骤一次。4. 将细菌沉淀，重悬于100l用冰预冷的歌溶液GTE溶液(溶液I)中，涡旋混合仪上剧烈振荡至完全悬浮无块状物。用微量离心机于4以12000g离心30秒，收集沉淀，弃去上清液。5. 将细菌沉淀，重悬于100l用冰预冷的歌溶液GTE溶液(溶液I)中，涡旋混合仪上剧烈振荡至完全悬浮无块状物。6. 加200l新配制的变性裂解溶液 (溶液：溶液中含0.2mol/L NaOH，1%SDS现配现用)，盖紧管口，快速颠倒离心管次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液接触。不要振荡，将离心管放置于冰上，至溶液半透明，时间不可以超过5分钟。7. 加150l用冰预冷的Kac-AC溶液(溶液)盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上分钟。8. 用离心机12 000g离心10分种，将上清转移到另一离心管中。9. 在通风厨中加241的氯仿：异戊醇500ul ，在涡旋混合仪上混匀1min。10. 12000rpm离心7min.，轻柔取出离心管，不要晃动。此时离心管中会分为上下两相，下层为有机相，上层为水相，DNA存在于水相中。 11. 用移液器小心缓慢吸取上层上清液约350-400ul，不要吸取浑浊中间相。12. 加入800ul无水乙醇，室温静置10min.13. 12000rpm离心10min.，小心倒除上清液，保留絮状沉淀，并用75的乙醇冲洗2次(如沉淀分散可重复本次离心步骤)。14. 倒立离心管1min，水平放置离心管至管内完全干燥至沉淀透明。15. 每管加入40ulTE和0.5ul RNase(1u/ul) 4C溶解DNA过夜。16. 20C保存备用。五、结果与分析细菌质粒DNA分子应为环状分子，溶解后为透明溶液，沉淀时为透明至白色，因此，本次实验中，在DNA沉淀干燥后，应能看到白色沉淀，如果看不到白色沉淀，说明提取失败。主要原因有：加入无水乙醇后沉淀时间不够；75%乙醇漂洗时DNA沉淀随乙醇被弃去。提取的DNA的浓度、质量将在实验三中通过电泳进行定性、定量分析。实验三 核酸电泳(综合实验，必开)DNA琼脂糖凝胶水平电泳(3学时)电泳是核酸、蛋白质等大分子物质的一种分离、鉴定、纯化的技术。核酸电泳是分子生物学的基本技术之一。用于核酸分离鉴定的主要有琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、脉冲电场凝胶电泳等。用于DNA质量检验的一般是琼脂糖凝胶电泳。一、目的和要求(一)目的：1、掌握DNA琼脂糖电泳的原理。2、学习DNA琼脂糖电泳的操作过程方法和结果观察方法。(二)要求1、电泳过程为演示实验，结果观察为单人操作。2、在3小时内完成。3、完成实验报告1份。二、实验原理在电场中，带电生物大分子会定向运动。带电分子的迁移速率与电场电压成正比，与电泳介质阻力成反比。要分离、纯化、检测的对象不同，所用的电泳介质、电压往往不同。用于核酸电泳的电泳介质有丙烯酰胺(PAGE)、琼脂糖，分别称为丙烯酰胺电泳和琼脂糖电泳。电泳介质的阻力主要取决于电泳介质的胶联孔径，主要由胶联时的介质浓度确定。由于相同大小的生物大分子在电场中的迁移速率相同，不同的分子迁移速率不同，从而可以区分不同的分子。为了能够观察核酸分子，通常使用核酸染色剂。溴化乙锭(EB)是一种常用的核酸染色剂，这种染料嵌入到核酸分子的碱基之间后，会靠碱基堆集力稳定，未嵌入的EB可以漂洗除去。EB在激发光下可以发出荧光，因此可以看到核酸的位置。 三、材料、仪器和试剂（一）材料电泳DNA样品为上两次实验产物，每人每次的提取产物随机即取1份，根据电泳结果进行评分。(二)仪器：1. 电泳仪2. 水平电泳槽及附件3. 移液器1000ul4. 移液器20ul5. 枪头盒1000ul6. 枪头盒20ul7. 微波炉或电炉8. 天平9. 紫外反射透射分析仪10. PVP手套（三）药品准备1、所需药品溴化乙锭琼脂糖TrisHCl冰醋酸EDTA溴酚兰蔗糖蒸馏水标准DNA2、母液准备(1)溴化乙锭(10mg/ml)：称取1g的溴化乙锭，溶于100ml蒸馏水中，磁力搅拌器上搅拌数小时，或称取10mg的EB，置于1.5ml离心管中，加入1ml蒸馏水涡旋混匀，注意EB要充分溶解。(2)50TAE：羟基甲基氨基甲烷(Tris)242 g，冰乙酸57.1 mL，0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(Ph8.0)100 mL，灭菌双蒸水定容至1 000 mL。(3)6上样缓冲液：含0.25溴酚蓝，40（w/v）蔗糖的水溶液。四、实验步骤1. 样品准备：取提取的植物基因组或细菌质粒DNA3ul加加样缓冲液1.5ul加水4.5ul，混合均匀，并短时离心收集到离心管底部。上样缓冲液不仅能够提高样品的密度，使样品均匀沉到点样孔底，而且使样品带色，既便于上样，便于判断电泳时样品的位置。2. 称取适量琼脂糖加入用1TAE电泳缓冲液将琼脂糖悬浮并在水浴上或微波炉中用最短的时间加热融化，配置成所需浓度(植物基因组DNA按0.8%，细菌质粒DNA按照1%)，冷却到60度，加入溴化乙锭（终浓度为0.5ug/ul）充分混匀。3. 用胶布将洗净干燥的胶模的两端封好，形成一个胶模。4. 根据上样量的大小选择适当的梳子，在胶模中放置好梳子，使梳齿高于底板12mm。5. 倒入温热的琼脂糖溶液，使厚度大概为35mm,用吸管吸出气泡。6. 放置3040分钟让凝胶完全凝固，除去胶床两端的胶布，放进电泳槽中。7. 加入电泳缓冲液，使液面高出胶表面2-3mm，不要超过1cm，小心的拔出梳子，并用吸管吸出样品孔中的气泡，以免影响上样。8. 将样品与上样缓冲液混匀（按10ul样品加3ul上样缓冲液），上样缓冲液不仅能够提高样品的密度，使样品均匀沉到孔底，而且使样品带色，既便于上样，又便于估计电泳的时间和判断电泳的位置。9. 用微量可调移液器上样，注意防止手抖动，并且注意在样品不一样时要更换枪头，或在阳极缓冲液中冲洗几次。10. 盖上电泳槽盖，接通电源，按每1cm电极间距加35v/进行恒压电泳，当溴酚蓝指示剂走到胶的前缘约3/4处，切断电源，电泳完毕。11. 电泳结果观察：将电泳完的凝胶放置到紫外光下看，有条件的情况下进行拍照，分析DNA样品的浓度、纯度、提取质量。五、结果与分析通常由于植物基因组较大，在提取过程中会被剪切成21kb左右的片段，因此，高纯度的DNA应出现1个条带。条带的强度与浓度成正比，样品有蛋白或多糖等杂质存在时会留在点样孔中，有RNA存在时RNA也会出现条带，DNA 降解时会出现条带弥散。据此可以判断DNA质量、浓度、纯度。细菌质粒DNA由于是环状分子，因此通常会出现开环、缺刻、环状、超螺旋等形态，因此经常可以在15004000bp范围内观察到34条带。如果混有基因组DNA则会出现大片段，混有RNA则会出现RNA 条带。同理可以判断其提取质量、浓度、纯度。实验四 聚合酶链式反应(综合性实验，必开)基因扩增(3学时)聚合酶链式反应是现代生物技术的基本技术，基因克隆、重组子检测、转基因生物筛选都可用PCR技术来完成。因此，掌握PCR技术的基本原理和基本操作是生物技术课程的基本要求之一。一、目的和要求(一)目的：1、掌握PCR技术基本原理。2、学习PCR操作的一般方法和过程。(二)要求1、本实验分4-6组进行，分组集体完成，每小组做两个反应(2管)。2、在3小时内完成，反应管按分组号编号(如1a、1b)并上交。3、完成实验报告1份。二、原理PCR模拟DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与目标序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至94左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，经过30次以上的循环就能将待扩目的基因扩增成几百万倍。三、材料、仪器和试剂(一)、材料：植物基因组DNA，每组1份，目标序列特异引物1对2条。(二)、仪器1、200ul移液器：4-6支2、200ul枪头盒：4-6个3、2 0ul移液器：46支4、2 0ul枪头盒：46个5、2.5ul移液器：46支6、台式高速离心机：24台7、冰盒或冰盘：46个8、0.2ml离心管：每组24个9、0.2ml离心管盒：每组1个10、电泳仪11、水平电泳槽及附件12、移液器1000ul13、枪头盒1000ul14、微波炉或电炉15、天平16、紫外反射透射分析仪17、PVP手套 (三)、试剂1、需要的试剂Taq DNA 聚合酶超纯水dNTPPCR bufferMgCl2溴化乙锭琼脂糖TrisHCl冰醋酸EDTA溴酚兰蔗糖蒸馏水标准DNA2、需要配制的试剂模板DNA：200 ng/ul引物1：20uMmol/L引物2：10uMol/LdNTP:2mM/L溴化乙锭(10mg/ml)：称取1g的溴化乙锭，溶于100ml蒸馏水中，磁力搅拌器上搅拌数小时，或称取10mg的EB，置于1.5ml离心管中，加入1ml蒸馏水涡旋混匀，注意EB要充分溶解。50TAE：羟基甲基氨基甲烷(Tris)242 g，冰乙酸57.1 mL，0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(Ph8.0)100 mL，灭菌双蒸水定容至1 000 mL。6上样缓冲液：含0.25溴酚蓝，40（w/v）蔗糖的水溶液。3、实验用试剂(每组1份)模板DNA：200 ng/ul引物1：20uMmol/L引物2：10uMol/LdNTP:2mM/LTaq DNA 聚合酶超纯水10PCR buffer25mM MgCl21TAE:去一份50TAE，加49份水，混匀即可。四、实验步骤1、反应体系将所需试剂取出后置冰盘上，离心管放在冰上，按顺序加入以下试剂：超纯水：200ng/ul模板DNA:2ul10uM引物1：2ul10uM引物1：2ul2mM dNTP: 2.5ul10PCR buffer:2ul25mM MgCl2:1.7ul5u/ul Taq DNA聚合酶：0.3ul离心机上短时离心，轻敲离心管混匀后，重复短时离心，将试剂收集到离心管底部。2、PCR反应程序打开PCR仪，按如下步骤设置反应程序：94，2分钟94，1分钟55，90秒(温度根据引物设定)72，90秒，返回到步骤(2)，重复30次72，5分钟8，保持end3、产物检查进行琼脂糖凝胶电泳，实验过程参照实验3。五、结果与分析PCR就是模拟生物体内DNA的复制过程，在体外复制2个引物之间的DNA片段。因此，利用基因两端设计引物，就可以扩增出整个基因片段。因此PCR的引物决定了扩增的区域。引物的特异性是本试验成功的关键。PCR反应结束后，通过电泳，可以观察到PCR反应中被大量复制的片段。如果观察到多个条带，说明引物特异性较差，在模板DNA上有多个结合区域，多个片段被复制；如果没有观察到任何片段，说明个别小组PCR反应失败，可能原因为加样错误，集体PCR失败，可能的原因为试剂失效、加样错误、反应条件错误、引物不适宜等。实验五 植物转基因实验(综合实验，待开)农杆菌介导叶盘转化法(6学时，分两次进行)基因转移是现代生物技术的核心，对农科类专业来说，有必要了解植物基因转移的方法或过程。一、目的和要求(一)目的：1、掌握农杆菌介导转化法的原理。2、学习农杆菌介导叶盘转化法的操作过程和方法。(二)要求1、本实验进行培养基制作、接种转化和培养过程，培养基制作分组进行，接种和培养为单人操作。2、在6小时内完成，第一次完成培养基制作，第二次进行转化和培养。3、每人完成实验报告1份。二、实验原理农杆菌可以通过Ti质粒上的毒区基因将质粒上的T-DNA区域转移并整合到植物的基因组DNA上。将植物叶片剪成叶盘，造成较大的伤口/面积比，更好的诱导农杆菌活性，提高农杆菌侵染的机会与效率，从而可以获得较高的转化效率。农杆菌转化可以在很短时间内约14天完成转化，转化完成后，将农杆菌除去，通过抗性筛选，可获得转基因抗性芽，进一步筛