从鲎试剂生产废料中提纯鲎素的方法研究.doc

从鲎试剂生产废料中提纯鲎素的方法研究【摘要】目的建立从鲎试剂生产废料中纯化鲎素的方法。方法用酸处理和sephdexG50凝胶层析法从鲎试剂生产废料中提纯鲎素。结果经凝胶层析纯化样品在SDSPAGE中显示单一蛋白质条带。鲎素分子量约3kD左右。提取的鲎素能显著抑制大肠杆菌的生长，IC50为3.9mg/L。进一步研究显示，提取到的鲎素不仅抑制普通大肠杆菌的生长，而且可以显著抑制耐氨苄青霉素或耐卡那霉素的大肠杆菌的生长。结论本文建立的方法可成功地从鲎试剂生产废料中提取到纯化的鲎素。 【关键词】 鲎素；纯化；抑制；废料基金项目:广东省重点学科经费资助，广东省中医药局基金资助项目2006（No.1050047），湛江市科技计划项目（2005）Purification of tachyplesin from the wastes of tachypleus amebocyte lysateCHEN Weizhu， WANG Yajun， ZHANG Haitao Department of Biochemistry and Molecular Biology, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, China Abstract:Objective To establish a feasible method for purifying tachyplesin from the wastes of tachypleus amebocyte lysate (TAL).Methods Tachyplesin was extracted from the wastes of TAL by acidation and gel chromatography.Results The purified sample appeared single band on SDSPAGE. The molecular weight of peptide is about 3 kD. Tachyplesin inhibited Escherichia coli as well as ampicillinresistant or kanamycinresistant Escherichia coli,with IC50 of 3.9mg/L for Escherichia coli.Conclusion The present method is feasible for purifying tachyplesin from the wastes of TAL. Key words:tachyplesin; purification; inhibition; wastes 节肢动物门动物的淋巴细胞中存在多种抗菌蛋白质和肽类，这些物质作为动物免疫防卫系统中的重要成员，在抵抗微生物的感染中发挥着重要作用。鲎血细胞目前主要用于制备鲎试剂，广泛用于药品的内毒素检测。其生产的废料是不溶于水的细胞膜，我们前期的研究发现在这些生产废料中含有大量抗菌、抑制内毒素反应的活性蛋白质（多肽），这些物质抗菌效果好，稳定性佳，存在很大的利用价值2。目前尚未见报道从鲎试剂生产废料中提取鲎素的研究，建立从鲎试剂生产废料中纯化鲎素的方法，可为对进一步开发鲎素奠定方法学基础。本文对这一抗菌肽作了提纯方法的研究，并对抑菌效果作了观察，现将结果报道如下。 1 材料与方法 1.1 试剂与仪器 Sephadex G50(Pharm )，四甲基乙二胺，丙烯酰胺，N，N 一甲叉双丙烯酰胺，考玛斯亮蓝， 十二烷基硫酸钠，甘氨酸，蛋白胨, 酵母提取物。自动低压液相色谱分离层析仪（上海，嘉鹏），CF16RX冷冻离心机（日本），VARIOSKAN FLASH连续光谱荧光酶标仪（美国），FluorChemTMSP全自动荧光化学发光可见光数字图像分析系统（美国），BioRad垂直电泳槽（美国），UV2100分光光度计（上海，尤尼柯） 1.2 鲎试剂生产废料的处理2 从鲎试剂生产厂家收集鲎试剂生产废料用蒸馏水漂洗2次，将沉淀悬浮于20mmol/L盐酸溶液，匀浆，8000r/min离心30min，收集上清液，备用。 1.3 凝胶层析分离蛋白质与蛋白质定量23 将上清液用Sephadex G50分离，20mmolL盐酸洗脱，流速1.0mLmin，收集280nm具光吸收峰物质。共收集三个洗脱峰。用考玛斯亮蓝法测定蛋白质质量浓度。 1.4 洗脱峰样品聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 加入等体积的2×上样缓冲液(62.5mmol/L Tris,10%甘油,2%SDS,0.02%溴酚兰,5% β巯基乙醇)。12%的分离胶:H2O 1.6mL,30%丙烯酰胺溶液2.0mL,1.5mol/L trisHCl(pH8.8) 1.3mL,10%SDS0.05mL,10%过硫酸铵0.05mL, TEMED 0.004mL。电泳缓冲液:25mmol/L TrisHCl,250mmol/L甘氨酸,0.1%SDS,pH8.3。加样前将样品煮沸5min。先恒压90V,溴酚蓝到分离胶时,将电压升至200V,待溴酚蓝快到达分离胶底部时,停止电泳,剥离胶。 1.5 测试菌株与抑菌试验4 大肠杆菌(ATCC25922)、耐氨苄青霉素大肠杆菌和耐卡那霉素大肠杆菌从中国生物制品所购进。菌株用LB培养基培养，收集对数生长期大肠杆菌，按质量浓度接种细菌，分别加入不同质量浓度的各个洗脱峰的中和样品，37培养24h,取出样品，于630nm波长测定浊度，确定细菌生长速度。 1.6 对不同耐药菌的抑制作用 细菌培养条件同上，接种细菌，加入不同质量浓度的C洗脱峰样品，37培养24h,取出样品，于630nm波长测定浊度，确定细菌生长速度。 1.7 统计学处理 数据以均数标准差表示，采用单因素方差分析和Dunnet t检验。 2 结果 2.1 样品洗脱曲线 结果如图1所示，样品经Sephadex G50分离，可获得三个蛋白质峰。 2.2 蛋白质质量浓度定量 用考玛斯亮蓝法测得上样前样品原液质量浓度为1689 mg/L，A收集峰质量浓度为1178 mg/L，B收集峰质量浓度为850 mg/L，C收集峰质量浓度为150 mg/L。 2.3 蛋白质电泳分析电泳结果显示（图2），经过纯化获得的鲎素，分子量与胰岛素相似。胰岛素经SDSPAGE电泳显示3kD左右的单链，获得的小分子量多肽是3kD左右(纯净鲎素的分子量是2.3kD)。 2.4 A、B、C三个收集峰的抑菌效果 结果见表1。A洗脱峰的样品抗菌效果不明显，而B洗脱峰的样品要大于40 mg/L才有明显的抑菌效果，IC50=40 mg/L。C洗脱峰的样品5 mg/L表现出强的抑菌效果，质量浓度大于10 mg/L细菌不能生长，IC50=3.9 mg/L，与文献4报道的鲎素抑制大肠杆菌IC50=3 mg/L相似。可见抗菌活性物质鲎素主要在C收集峰。表1 不同质量浓度蛋白质收集峰的抑菌效果（略） 2.5 鲎素对耐药菌的抑制效果 鲎素主要存在C收集峰，观察C收集峰对大肠杆菌、耐氨苄青霉素和卡那霉素大肠杆菌的抑制效果。结果显示，非耐药菌株和耐药菌株均对C洗脱峰敏感，详见表2。表2 C收集峰对耐药细菌生长影响（略） 3 讨论 从鲎血细胞中可提取多种生物活性物质，但目前主要是裂解鲎血细胞获得鲎血凝固系统的各种酶类用于制备鲎试剂。本文采用酸提法和SephadexG50凝胶层析从鲎试剂生产丢弃的细胞膜中分离出三组蛋白质（肽）成分。经抑菌试验发现，其中凝胶层析的C收集峰具有强烈的抑制大肠杆菌生长的能力，B收集峰具有弱的抑菌效果，而A收集峰在所试验的质量浓度范围内未见有明显的抑菌效果。 SephadexG50凝胶层析的分子量排阻范围是5kDa，所以C收集峰洗脱的蛋白质分子量小于5kD，属于肽类的分子量范围。C收集峰抑制大肠杆菌的IC50=3.9 mg/L，与文献4报道的鲎素抑制大肠杆菌IC50=3 mg/L相似。可见抗菌活性物质鲎素主要在C收集峰。这提示C收集峰中存在一种能够强烈抑制大肠杆菌生长的抗菌肽。查询文献和经抑菌实验可以推断C收集峰含鲎血细胞的抗菌肽鲎素。B收集峰的样品质量浓度大于40mg/L时具有抑菌效果，IC50=40mg/L。这组分蛋白质中可能也含有一些抗菌的蛋白质或含有先洗脱下来的鲎素。 鲎血细胞中存在一些小分子量的抗菌多肽，其中鲎素是一种抑菌效果最好的抗菌肽，构象研究显示鲎素是反向平行的β折叠构象，其间以β转角相连接，形成两个二硫键。在该结构中，疏水的氨基酸定位于平面的一侧，6个阳离子氨基酸残基则出现在分子尾部，因而这种结构也是两亲的5。革兰阴性菌的细胞膜是一个具有两膜系统的复合结构，内膜上有呼吸酶，外膜上有带负电的脂多糖分子作为疏水分子的屏障。鲎素是阳离子多肽，具有与脂多糖分子结合的分子基础，可以破坏外膜结构以便穿越外膜屏障到达内膜，并与细菌内膜结合形成通道，改变膜的通透性使胞内的K析出，并引起与呼吸相关的质子运动力的下降，ATP量下降和新陈代谢的丧失，从而影响大分子的生物合成而起到杀菌作用56。 在目前临床上病原菌对抗生素逐步产生耐药性，而发现新的抗生素极其困难的情况下，鲎素具有分子量小、热稳定、水溶性好、抗菌谱广及材料来源丰富等优点。并且由于鲎素作用的主要机制是破坏膜结构的完整性，影响了电化学势和离子平衡，造成了细胞膜内容物的泄漏，最终导致细胞死亡，这就使细菌不易对鲎素产生耐药机制。 本文的结果也显示，用含鲎素的C收集峰的样品不仅抑制非耐药的大肠杆菌的生长，而且能抑制耐氨苄青霉素和耐卡那霉素大肠杆菌的生长。电泳分析结果显示，C收集峰中含有一分子量3kD左右的条带。从提取的效率来看，原液1689 mg/L的蛋白质，可以获得150 mg/L的鲎素，样品被稀释了10倍，鲎素产率可观。提示采用本法可以有效地将鲎素从鲎试剂制备副产物中提取鲎素，为大规模从鲎试剂生产废料中纯化鲎素，及将鲎素开发成新的抗生素奠定了技术基础。【参考文献】 1IWANAGA S. Recent advances in the innate immunity of invertebrate animalsJ.J BiochemMol Bio，2005，38（2):128150.2张海涛，梁景耀，翁云，等.鲎血细胞有效组分生物活性的初步研究J. 海洋科学 2000,24(10):4850.3BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye bindingJ. Anal Biochem ,1976，72:248254.4NAKAMURA T， FURUNAKA H， MIYATA T， et a1. A class of antimicrobial peptide from the hemocytes of the horseshoe crab (Tachypleus tridentatus) J. J Biol Chem，1988, 263(32):1670916713.5DOHERTY T, WARING A J,HONG M.Peptidelipid interactions of the betahairpin antimicrobial peptide tachyplesin