凝集素在生物分子分离提取中的应用.doc

植物凝集素最早发现于1888年，Stillmark在蓖麻(Ricinus communis L)籽萃取物中发现了一种细胞凝集因子，它具有凝集红细胞的作用。它是一类具有特异糖结合活性的蛋白，具有一个或多个可以与单糖或寡糖特异可逆结合的非催化结构域。植物凝集素对真菌的抗生效应可能与它特异结合暴露于真菌细胞壁表面的糖复合物并导致真菌细胞壁及菌体结构形态改变有关，凝集素可与真菌表面的葡聚糖、半乳糖、甘露糖等多糖结合，干扰真菌细胞壁的合成，影响其细胞的正常代谢。凝集素（Lectin）是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血球（含血型物质），故名凝集素凝集素最大的特点在于它们能识别糖蛋白和糖肽中，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的碳脂化合物决定簇。一种凝集素具有对某一种特异性糖基专一性结合的能力，如刀豆素与D吡喃糖基甘露糖（DMannopyranosy）结合；麦芽素与N乙酰糖胺（Nacetyl glucosamine）结合；菜豆凝集素与N乙酰乳糖胺结合（见本章表61）。 因此，凝集素可以作为一种探针来研究细胞膜上特定的糖基。另一方面，凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合，从而在光镜与/或电镜水平显示其结合部位。凝集素可为荧光素、酶和生物素等所标记，分别进行下列染色法： 直接法标记物直接标记在凝集素上，使之直接与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合。 直接法的优点是简便，目前商品用的凝集素药盒已能购得。但灵敏性不够高。 间接法将凝集素直接与切片中的相应糖基结合，而将标记物结合在抗凝集素 凝集素受体表达抗体上间接法较直接法和直接法敏感性高510倍或更多一些，但必须购买或自制抗凝集素抗体。糖凝集素糖法本法是利用过量的凝集素与组织切片中特定的糖基相结合。经冲洗后，凝集素上还存在未被占用的结合部位，将这些部位与有过氧化物酶标记的特异性糖基相结合，形成一个三明治样的糖凝集素糖的结合物。 本法特异性强，灵敏度高，因为这不象生物素抗生物素法那样要改变凝集素，又不需要像抗体那样要制备抗体。方法虽不复杂（Lee 等1976），但需一定的试剂和设备。商品化能提供的糖基化过氧化物酶品种尚有限凝集素在动、植物体内广泛存在。凝集素最大的特点是能识别糖蛋白和糖脂中，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的糖基。一种凝集素具有只对某一种特异性糖基专一性结合的能力。因此，凝集素可以作为研究细胞膜结构的探针。凝集素在无脊椎动物血液中具有多种生物活性，可以选择凝集各种细胞，对肿瘤细胞有特异性凝集作用等，是免疫防御的重要体液因子之一。另一方面，凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、酶、生物素、铁蛋白及胶体金等结合、而不影响其生物活性，可用于光镜或电镜水平的免疫细胞化学研究工作，在探索细胞分化、增生和恶变的生物学演变过程，显示肿瘤相关抗原物质，以及对肿瘤的诊断评价等方面均有一定的价值。此外，植物凝集素在植物体内也具有相当重要的作用，如在种子萌发过程中的作用；作为植物胚细胞的促有丝分裂因子；在作物害虫防治方面表现出的保护功能等等。研究凝集素的特异性有助于以分子或原子层次 (Molecular or atomic level) 了解生命现象或病理变化。 物大分子制备的前处理l 2.2.1 生物材料的选择l l 制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。l 选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。l 动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。l 植物要先去壳、除脂。l 微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。l 生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。 2.2.2 细胞的破碎ll 不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。 (1)机械法：l 1) 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆。l 2) 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/min20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎生物大分子的提取ll “提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程。 影响提取的因素主要有：ll 目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；l 由固相扩散到液相的难易；l 溶剂的pH值和提取时间等。 通常：ll 极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；l 碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；l 温度升高，溶解度加大；l 远离等电点的pH值，溶解度增加。 提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性。l生物大分子的分离纯化ll 由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的。l 为了避免盲目性