使用短肽作为构建块层 (1) 2 (1).doc

2013-2014学年第1学期 生命科学 学院期末考试卷药物化学学号: 201172020144 姓名: 张明艳 班级: 11级-生物技术 成绩：评语：（考试题目及要求）：见附页 通篇修改诸如红色标出的全文翻译不当按照模版修改全文格式图居中 使用短肽作为构建块层 - 层聚合物表面的生物分子大会 摘要：通过层 - 层组装成多层膜掺入低分子量药物和治疗肽组装成单层膜有可能提供技术手段到目标网站，并提供小分子来调整释放他们。这项研究描述了使用具有疏水性和静电的相互作用，将一十三肽的抗炎激素，促黑色素细胞刺激素（ -MSH ） ，作为在基地构建基块多层透明质酸、 壳聚糖 （CS） 的程序集的乳酸-羟基酸PLGA曲面，一系列交换层，包括一个中性脂质DOPC，带负电荷的脂质混合物DOPC / DOPS 和带负电荷的多糖HA ，通过考察他们的能力，来支持后续的HA和CS层，分子动力学模拟进行审查-MSH 在溶液中及其表面上的结构和表面化学性质，提供了条件最有可能用来支持多层组装。多层组装大会稳定在生理PH下，并已成功地应用于颗粒物系统。 目录1. 简介2. 材料与方法 2.1.石英晶体微天平测量 2.1.1.羟基乙酸共聚物膜的制备 2.2 .PLGA 微球的生产 2.3 傅里叶变换红外显微镜 2.4.圆二色性 2.5.分子动力学模拟 2.6.层由层程序集与 PLGA 生物分子的微球 2.7.共焦激光扫描显微镜3. 3.1.嵌入 -MSH的成多层膜 3.2 -MSH 对 PLGA 膜的吸附 3.3.- MSH的二级结构 3.4.- MSH在溶液中的分子动力学模拟 3.5. MD 的 -MSH 在疏水表面上的模拟 3.6.层的层的程序集 3.7.翻译到3D 曲面4.结论1. 简介层 - 层（LBL）组件是一个多用途的技术，它能通过互补的化学作用力将材料相继地沉积下来从而形成多层膜材料，一系列的相互作用，包括静电引力，氢键， DNA杂交，化学反应和疏水相互作用已被用来生产多层材料.例如多样性允许广泛的材料，包括合成的生物聚合物（带电和不带电），无机或金属纳米颗粒，蛋白质和小分子制造有功能的层层材料已被用于各个领域，特别是在生物材料领域，药物控释和组织工程。我们最近使用层层技术提供碱性成纤维细胞生长因子 ，利用这种生长因子和高度硫酸化多糖类之间互动的强大和良好的特点，使嵌入于多糖层的生长因子的释放率周期减短到60天。 许多新开发的药物的性能对层层技术提出了新的未来发展的挑战，许多小且疏水的短肽衍生物都是有限充电的。这样的小分子通过层层膜的扩散意味着他们不能得到充分和直接的层内纳入，提供有限的控制超过他们释放。 克服这个问题的方法之一是使负载小分子的电荷密度低到预制的胶囊或薄膜。装载机构通常由扩散的方式通过层-层薄膜，分子扩散的结果往往是在第一个48小时内在毛孔内有释放，另一个解决方案是在更大范围内使聚电解质的药物或肽加倍。这个策略有被使用，例如，系绳抗炎十三碳肽， -黑素细胞刺激素，聚-L-谷氨酸酸和封装中的抗肿瘤的药物，脂质体。这种共轭允许装配稳态大多通过层层技术层。 通过层层组装使小肽直接作为建筑物成分的使用，已经表明有很大的挑战.成功的寡肽直接蒸发在层层的过程中是取决于链的长度和缩氨酸的带电状况。由短肽 -L-谷氨酸（分子量为150 k Da的）聚-L -赖氨酸（分子量为3.8 k Da）形成层的不稳定性支持这一假说。 近日，由36个氨基酸组成且带九个正电荷的抗癌多肽和由40个氨基酸组成带五个互动的静电荷残基的小的抗菌肽防御素，已被证明与聚阴离子形成稳定的膜-肽且有线释放期超过7天。同样地，由32个氨基酸组成的多肽被专门设计成任一16个正电荷或负电荷的残基，电荷或负电荷残基已成功地运用层层技术为积木构造空心胶囊。这些研究包括利用层层技术多肽薄膜的制作和肽释放的控制代表一个重大的里程碑，同时利用静电和具体的短程相互作用，如面包车范德华力和氢键。 人体激素的抗黑色素细胞刺激素（-MSH）是潜在的层层组件的合适模型肽，因为它具有典型的许多新发展的药物。 1.6 k Da的肽有13个氨基酸残基是已知的调节体外和体内模型中的炎症中炎性细胞因子的产生。这种肽大多由疏水性的中性残基组成，与三个电荷的残基随机分布在骨干，谷氨酸，精氨酸，赖氨酸，这样有助于净电荷的生理pH值保持为+1 。以前，抗炎黑色素细胞刺激素共轭聚-L-谷氨酸，然后将其用于与相反电荷的聚-L-赖氨酸以创建生物活性涂层与抗炎症的假牙和牙科植物。然而，目前尚不清楚是否可以在没有层层组装的情况下将促黑色素细胞刺激素纳入。 我们先前已经表明，抗黑色素细胞刺激素可直接吸附表面上的可生物降解的聚合物，聚乳酸（ PLGA ） ，通过疏水性相互作用。在这个研究中，我们探讨 - MSH在溶液中的结构和PLGA结合后利用光谱技术分子动力学（ MD）模拟的目标决定挖掘层层沉积稳定的最佳条件。光谱技术分子动力学曾提供了关于层层技术的一些方面的见解，包括聚电解质络合他静电间的相互作用，疏水性关系相互作用，氢键的形成和二级结构，所有这一切都最终影响膜的稳定性，初步研究多层构造在一个平面系统和分子动力学用于模拟的疏水的 - MSH的分子排列模型表面，以确定用于离子的层层组装的最佳的配置。优化分层条件被认为是一个三维的结构，在这里多层颗粒将可能允许可调的促黑色素细胞刺激素释放，用来调节由生物材料和组织工程植物造成的炎症。2. 材料与方法2.1.石英晶体微天平测量石英晶体微天平（ QCM）是用来测量评估生物分子结合到一个2D的羟基乙酸共聚物的膜上。2.1.1.羟基乙酸共聚物膜的制备镀金的5MHZ切石英晶体在二氧杂环己烷中浸泡1分钟后，然后再用混合的纯净水清洗，再与氨和过氧化氢以体积比为5:1:1在 75度的条件下反应5分钟，.然后将晶体彻底用纯净水冲洗，最后用乙醇清洗，将结晶侵渍在5mM的 1 - 乙基3 - 巯基乙醇溶液中12小时，然后用羟基乙酸共聚物旋涂，在1的二甲基碳的溶液中旋涂羟基乙酸共聚物，然后在3000rpm下结晶2分钟并且在75的热板上退火2小时，这便成了羟基乙酸共聚物的膜。 为了探讨聚电解质层之间促黑色素细胞刺激素的整合， 羟基乙酸共聚物膜晶体首先在室温下浸泡在3 的1,6 - 己二胺和异丙醇溶液中30分钟。剩下的结晶，用纯化水在0下侵泡三次，再进一步在0下侵泡1小时，在真空下干燥，存储在硅胶的干燥器中12h，直至进一步用于其他的实验中， 羟基乙酸共聚物涂层的晶体是氨基裂解的。然后将处理或未经处理的结晶放置在一个Q感为D300的分析室中。2.1.2. 层-层大会上平面曲面 这项研究为编写生物分子提供了解决方案。促黑色素细胞刺激素肽肽定制合成了 -大小由CS生物与 95 纯度的肽和肽的质量通过质谱证实，多肽被溶解在任一用5 M Na OH调节的PH为5.5，50 g/m l 的浓度为10mM乙磺酸缓冲液中，已得到调整到 或 10 毫米招聘缓冲区中的已调整到 pH 9 的1 M 盐酸壳聚糖 中期的一个分子量 CS，粘度为 286 c P、 多编号 准备在 5 毫克/毫升浓缩的0.1 M 乙酸 。壳聚糖及透明质酸 都在 con-编写中心偏的 50 g/m L p h 值为 5.5 浓度为10 毫米 的MES 缓冲区中。为了研究脂质吸附在 -MSH涂层的水性缓冲液中。在单层脂质体的制备由类脂溶液在氮气1小时，以产生2.5毫克蒸发氯仿两性离子脂质或带负电荷的2.5毫克的DOPC ： DOPS以4:1的比率。干燥脂质然后用1mL的MES或TRIS缓冲液取决于水合对于分层所需的pH值。将每个溶液挤出，通过50 n m的外部滤波聚碳酸酯（滤纸， ME） 31次获得单分散尺寸的脂质体。由此产生的脂质体然后稀释至1mg/m L的为分层的QCM晶体。 一旦基线获得，在任一 p h值为9的-MSH 溶液 或 在10 毫米 MES 黄油在色版 10 毫米MES黄油用于装配在初始层 PLGA 涂层表面上。切换图层用于组装在PLGA涂层的表面的初始层。该交换层通过引入两种医管局的组装在10mM的MES缓冲液，pH为5.5或DOPC在10mM T r is缓冲液在pH为9或10 m M的MES缓冲液中，它的pH为5.5，取决于pH值的- MSH吸附或DOPC / DOPS 10mM的MES系统缓冲液pH 为5.5 。一旦切换层形成时，多层薄膜，继续在CS交替吸附和HA直至各层的期望数目已经建立。所有的HA用于分层处理的解决方案已经被激活如上面所描述的交联剂。所需的解决方案进行了介绍，并培养在测量范围内室，直到观察到的频率没有进一步的变化，这表明平衡已经达成。样品漂洗，以除去未吸附的生物分子具有相同缓冲区用于加载引进了新的解方案之前，为下layer.Each时间的新缓冲液，一个新的基准建立后，测量被收集在5兆赫，以及所述第三，第五和第七泛音（ 分别是14.9 ， 24.9 ，和34.9兆赫）的基频。与在QCM室中的温度保持恒定在23.5 。材料（M ，毫微克/厘米）吸附在PLGA使用er br e y 方程 (当量 1) M=c F 其中 c 是常数 17.7ng /(cm Hz)，F 是由于沉积的材料 (Hz) 频率的变化。2.2 .PLGA 微球的生产PLGA微球使用油包水乳状液和如先前所描述的溶剂蒸发技（术进行生产。简言之，将10的（重量/体积）的PLGA溶液的制备在二氯甲烷中，将聚合物溶液乳化在1 （重量/体积）的聚（乙烯醇）水溶液 ，在1500转用IKA RW 20顶置式搅拌器 与一个径流式涡轮。 乳剂搅拌过夜使大部分的DCM蒸发，所得在聚合物沉淀和固体的形成微球体。将所得微球5250 g离心5分钟，离心收集并用纯净水洗涤5次。然后大气条件下干燥24小时。2.3 傅里叶变换红外显微镜吸收纯化和 -MSH对PLGA的二级结构的微球是通过探测傅立叶变换红外光谱（FTIR ）显微镜。加载未改性的PLGA微球安装在EZ-现货微型摩样品幻灯片。 FTIR光谱收集在海波在反射率3000焦平面阵列模式为4厘米， 128扫描的光谱分辨率使用布鲁克作品6.5软件（布鲁克Optics公司，美国）。数据收集1600厘米和1840厘米之间的酰胺I区域，并且通过使用加权平均滤波的5个数据点。这项研究进行基础设施红显微光束线在澳大利亚同步加速器，澳大利亚维多利亚州。2.4.圆二色性远紫外圆二色性(CD) 光谱在一个J 815 CD 光谱仪使用 1 毫米的路径长度、 石英试管。在 10 m M 收集了 CD 光谱的 100 g/m l -MSH缓冲液 p h 值为 9 和 10 毫米 MES p h 值为 5.5 的缓冲区中。 -MSH 肽的结构也被判断从 PLGA 表面吸附，解吸。150 毫克PLGA 微球的示例被孵化与 3 毫升的250g/m L-MSH 溶液10 毫米的MES缓冲区在 pH 9 2 h以促进吸附。一旦被加载，-MSH 被释放到1 毫升的纯净水中 p h 值为 7 在 37摄氏度下72小时。悬浮液在 9000 g 下被离心 3 分钟。在卷上清含 -MSH 减至 100 L 使用真空离心浓缩仪在 45 摄氏度下，增加信号强度来记录有意义的频谱。水被选为释放介质，其 p h 值是生理 p h 值，盐的存在会导致重大散射后肽释放和缓冲的分光-中心偏前 CD 光谱。CD 谱的新鲜-MSH 在比较用水也被确定了。 所有样本的排烟是保持恒定在 23 摄氏度。在裁谈会期间使用循环水浴测量。光谱收集在185和260 n m处，之间以0.1 n m的间隔和扫描速率为50纳米/分钟。每个光谱扫描的平均值是6。进行CD光谱的反卷积，使用CDSSTR算法和DICHROWEB在线服务器。2.5.分子动力学模拟 -的模拟MSH （与乙酰化N-末端和酰胺化C端）的溶液中的肽放置在一个长方形的模拟箱40A的，溶剂化与2100点的简单构造费用（ SPC ）的水分子。对于模拟 pH值为9或5.5 ， 1或2个氯离子分别被列入溶剂，以以确保整体电中性。为了模拟在两个pH值值， -MSH建模与电荷的碱性和酸性侧链。在pH值为9 ，在他的侧链质子化只在N位置（中性残基），而在pH为5.5时双方的N及N仓质子（ +1电荷残基） 。对于这两种pH值为9和5.5 ，六个独立的模被执行的，与不同的起始肽的构象。这些包括一个全延伸链（图S1A的证明资料） ，一理想的-螺旋（图S1C ），两个紧凑型无规卷曲（图S1D ， E）和两个扩展无规卷曲（图S1F ， G） 。该后四种结构分别通过使用前奏曲获得和神游服务器来预测 -MSH构象和对应到4的低能量结构，例如用得分确定函数的方法。为了研究吸附的 -MSH 对 PLGA，我们作为简单的疏水板的近似聚合物表面组成的联合原子甲基 （CH3） 群体，服务于作为表面暴露丙交酯 methyls 的模型。有效性的这模型和亲水性表面暴露的可能影响在第 3.5 节中讨论组。-MSH 的模拟与建造疏水表面上的吸附了多肽最初放置大约 6 A 以上的制服, 平密不透风的表面。疏水表面是近似-作为两个图层 13 A 配对分开，每个组成的单个图层联合原子 CH3 微粒排列在一个六角形的格子的与 2.88A 的邻居最近的距离。此安装程序所示图 S1B。模拟细胞被溶解与 5300 SPC水和 1 或 2 Cl 根 p h 值 9 和 5.5，分别, 除了疏水板之间的空间。模拟作为德-在 p h 值 9 和 5.5 与质子化国家进行驿站上面。对这两种 p h 值的条件，与开始 （图 S1） 以上所述的相同的肽构象进行了六个独立模拟构如由得分确定函数此方法。 分子动力学模拟执行下进行的分子动力学模拟浓度恒定的粒子数，压力和温度下使用GROMACS版本4.5和GROMOS96力场与53A6的参数集（NPT）条件。仿真轨道采用时间步长为2 fs的集成。粒子网状埃瓦尔德（ PME ）的总和被雇用的评价长程静电，而1.0纳米的截止半径为用于短距离无粘合相互作用指定。共价键长度分别通过LINCS算法的约束。该模拟系统是用保持在300 K和1巴BERENDSEN温度和压力的耦合。分析MD轨迹被使用GROMACS套件进行的分析工具。使用Visual分子动力学（ VMD ）进行分子图形可视化。 共有24模拟被执行： 6各- MSH在溶液中，在疏水性表面，在pH值为9和5.5 。对于溶液系统中，收集的每600纳秒的轨迹在模拟中，而将表面吸附系统，收集每个仿真的500纳秒的轨迹。详情执行的仿真总结于表S1中的支持信息。2.6.层由层程序集与 PLGA 生物分子的微球PLGA 微球 (10 毫克) 是在第一次涂层时与1ml的50 g/m l的- MSH浸泡在 37 摄氏度下2 h 与 p h 值 为9 和10 毫米缓冲区中的溶液恒定混合在 90 rpm在 10 毫米的HA和 CS 溶液的MES 缓冲区中，其中pH 为5.5 ，200 g/m l 的浓度是用于涂料 PLGA 微球中的较高表面面积球系统相比，2D 的石英晶体。同样, 2.5 毫克/毫升的两性离子型脂质体在 10 毫米且p h 值 9 和负电荷脂质体在 10 毫米 MES 缓冲区p h 值为 5.5 的缓冲区的结果被用于分层。激活的HA和 CS分子每个沉积了 30 分钟而血脂获准 1 h 的较长期间，以确保最大绑定取得了每一层都基于初步意见从石英晶体微天平研究。在 1.7 毫升中执行所有分层聚丙烯微石英管内部 的旋转装置在室温下为90 rpm。将这种微球获 9240 g 3 分钟后每个离心分层的步骤和漂洗与要删除的加载缓冲区的 1 毫升未绑定的分子。此洗涤步骤重复了两次。2.7 .共焦激光扫描显微镜 PLGA微微球通过吸附从溶液涂有 -MSH 50微克/毫升的- MSH ，在pH 9 。荧光脂质体通过将荧光脂质1 - 油酰基-2 - 6 - （7 - 硝基-2-1 ，3 - 苯并恶二唑-4 -氨基己酰基 - s n-甘油3磷酸化酰胆碱（ NBD- PC），阿凡提脂类预先溶解于的DOPC和DOPC的形成过程中的氯仿/DOPS脂质体，得到总共10的标记的脂质中的脂质体制剂。 CS的样品标记有任罗丹明B （RHD ;西格玛奥德里奇，美国）或的Al e x a Fluor 488（ AF488 ; 公司，尤金，俄勒冈州）按照制造商的说明。 A滑动-A-L y ser透析盒（超强度，10000大截留分子量， 312毫升的容量 ,罗克福德，IL）被用于分离的未根据从所述标记的CS反应标记试剂的制造商的方案。PLGA 微球被分层与 -MSH-DOPC-（CS-公顷） 5、 -MSH-DOPC/扣分-(CS-HA) 5、 和-CS-(HA-CS) 3-EA-CS-EA作为描述耳-利尔。共焦激光扫描显微镜进行了LSM 5 帕斯卡显微镜配备 Neo fluor 40 .1.30DIC M27 油物镜(汉堡，德国卡尔 )。层层包裹的 PLGA 微球的样本被风干和放置在一滴油 层层涂覆的PLGA微球的样品空气干燥并放置在液滴的油成像的显微镜载片上。 图 1.频率 (黑色线) 和耗散 （灰线） 的更改期间层由层积聚的生物分子上 1，6-己二胺 PLGA 衬底存在下交联剂 EDC和全国保健服务。五个备用的 CS 和HA层被存入到 MSH多肽 (图箭头所示）中， 然后在 130 分钟后添加到带负电的HA层 (*)，在 250 min 后添加到带正电的 CS 层(*)且300 min后再次添加到带负电荷的HA图层 (*)。3.3.1.嵌入 -MSH的成多层膜 我们首先设置，以确定 -MSH是否可直接在评估生物分子组装的中间层内的浓度，带负电荷的聚电解质的透明质酸贺尔蒙（HA）和带正电荷的聚电解质的壳聚糖（CS）。一稳定的多层膜包括HA和CS在pH为5.5 时成功组装在一个 PLGA涂层的QCM电极上，其中所述的聚电解质是高度带电的，如先前报道。在这些条件下， HA将带负电荷而CS是带正电荷的，因为这些生物分子的p Ka分别大约是2.5和6.1 。 图1显示了在多层期间频率和耗散的变化的建立是由QCM决定的。这项技术可以检测出质量微小的变化，小到 10毫微克，由于改变了的电极的谐振频率。由于- MSH的等电点大约为10，肽预期在pH为5.5 ，由于胺的质子化正电上的精氨酸和赖氨酸残基在位置8和11（图2） 。它最初预期该肽能结合通过静电相互作用结合到相对电荷的表面，但 - MSH没有绑定到带负电荷的HA表面. 吸附 - MSH对HA-和CS涂层的缺乏表面就必须肽负载的另一种手段，为的是预计许多小的药物和肽。我们的发现是有一个小正电荷的观测一致抗生素，庆大霉素，不能轻易范围内通过静电相互作用成立聚电解质层。既庆大霉素和 -MSH可能从聚电解质扩散在组装过程中的表面，从而导致稳定的膜的失效增长。最近的研究报告中成功组装治疗性肽都涉及的多肽是至少3倍和5倍长度以上的高电荷比，促黑色素细胞刺激素证实了这些分子多层组件的依赖关系。 图2.（A） -MSH上的PLGA吸附一个50g/m L的溶液为pH值，这由石英晶体微天平在23.5摄氏度时测定。Etching所确定的函数PLGA表面的发生对应于阴影的pH值区域。 - MSH （B）净支出为pH值的函数。图形插图显示在- MSH的表面所涉及的关键残基吸附在pH 9和5.5 。3.2 -MSH 对 PLGA 膜的吸附 疏水性是另一个的化学属性，可以被利用的交付作为一种手段，建立层状材料来控制多肽的 -MSH释放。我们以前所报告的 -MSH 可以成功地吸附在 p h 值为 5.5，最有可能作为成绩的 PLGA 膜在聚合物和肽之间的疏水性相互作用。吸附的 -MSH 对 PLGA 被审查了作为函数p h 值，进一步探索和优化这种互动的后来构建此 -MSH 层之上。最高吸附的 -MSH 接近发生 p h 值为 9等电点 (p I) 的 10，如图 2 所示。它是一般观察到的最大吸附量发生在蛋白质的等电点区域。内的空间位阻斥力和-MSH 肽之间是接近 p I 的最低位置多肽有没有净电荷，而正电或负电在 pH 值较慢充电或高于 p I可能会减少多肽的吸附。 在频率上升时，观察到pH值为11 ，表明减少聚合物的质量（数据未示出）可以加速聚合物蚀刻和聚合物的水解。这种降解发生在溶液的pH值或以上并且防止 -MSH在测量pH值大于9时吸附，因此， pH值为9的溶液是最佳的，限制了在 -MSH肽的电荷和最大化和肽吸附，同时也避免了显著降解吸附于PLGA层。 二级结构的比例从使用DICHROWEB在线服务器和CDSSTR算法CD谱的去卷积估计。注意小数四舍五入估计，所以加总后不一定为1.0 。选择了 p h 值 9 和 p h 值 5.5的两种溶液为所有进一步的实验，来研究 -MSH 的吸附，作为这些代表吸附的 -MSH 的最佳条件聚电解质层分别是HA和CS。一个-MSH 在这些 pH 值上电荷的分布如图 2所示。3.3.- MSH的二级结构 - MSH是由探测远紫外圆二色性（ CD）来评估由溶液pH值的肽结构是否改变或吸附到PLGA表面上，最适pH 为9。该肽具有一个主要无规卷曲构象各溶液的pH值，与-链形成一个相似的比例并把结构由反褶积确定CD谱（表1）。光谱的形状，由图S2所示的的资料可知，与我们以前的研究结果即水中的pH为7是一致的 ，并取得了成果。肽的结构也大致维持不变，吸附在pH为 9和接近生理pH值之后（ pH为7 ），从PLGA表面（表和图S2）解吸时，一致用肽在pH7下观察。红外显微镜证实在 -MSH的存在下用主要是无序的结构吸附在PLGA表面，这时pH值为9 ，由高峰 1670厘米的酰胺I区（图S3的支持信息中）表示。这一发现与表1中呈现的CD数据是一致的。总之，这些结构数据表明，吸附 -MSH在pH 9不出现的肽的结构，这主要是无序的，并且这些条件可以被用于 -MSH在最佳负载产生不利影响子后续实验。3.4 ，- MSH在溶液中的分子动力学模拟 我们已经进行了互补的分子动力学模拟- MSH肽在pH 9和5.5的，以便更好地理解通过上面的CD在溶液中肽行为观察。六不知疲倦-悬而未决的模拟系统是采用不同的初始执行PEP-潮构象和600纳秒的轨迹为得到每个模拟（图S1中的支持信息中）。对于每个系统中，除非另有说明，所有的定量结果呈现关于分子动力学模拟给出平均超过六与第一50纳秒独立的轨迹排除以减少初始结构的每个轨迹相关的偏见。不确定性表示标准误差的手段。 图3. （一）直方图的端至端（ EE ）的距离（海里） MSH在溶液pH为9和5.5的组合轨迹。误差棒指出的手段标准误差。在代表结构选定EE距离显示为插图，用虚线双头箭头说明EE距离。 （ B，C ）大部分人口稠密的构象在溶液pH值为9 （ B）和5.5 （ C） 。括号中的数字显示时间结构的平均百分比的轨迹中存在（下划线），标准误差表示不确定性。分数表示的独立轨迹的数量（除了6），表现出各自的构象。 -MSH在溶液中的模拟使我们能够从结构和动态在不同的PH下获得见解、 肽事先与表面相互作用。我们注意到，这两种 p h 值为 9 和5.5、 肽展品坚固的结构灵活，表现出小小的二级结构和采用主要紊乱随机线圈结构，符合由CD中获得的实验数据。这一点迅速解开的初始理想， -螺旋轨迹 h-溶胶-ph9/5 和快速折叠x-溶胶-ph9/5 扩展绞线 （请参见表 S1 中支持信息的轨迹标签的详细信息）。 我们有为多肽结构特点它的端到端 (EE) 距离，测量之间中心的质量的乙酰基 N-末端和 C 末端酰胺群体。在这两种 p h 值的组合轨迹的直方图图 3A 所示的值。紧凑的发夹结构与EE 距离 1.5 n m）的较高 p h 值为 5.5。 图 4.直方图的-MSH 在v s溶液中的距离 (n m)， EE表面吸附 (A) p h 值为 9，吸附(B) p h 值 5.5。误差线指示标准误差的平均值。代表性的结构是嵌入。 对于每个pH值，我们聚集在一起的结构与标准方差（ RMSD ） 0.8 A ，以确定的主导肽的构象和它们的相对关系，提供这些结构在模拟过程中如何常出现的措施。这些结构示在图3B中（ pH为9 ）和图3C （ pH 5.5）中。在pH为9时，最优势构象（溶胶 - PH9集群）的平均值，在每次模拟轨迹时采用9+6 ，其结构包括一个秩序井然的-发夹结构，与位于一转的组氨酸。另一个最重要的簇通过第7 +3 ，同样包括A -发夹（数据未显示）。被填充的其他构象差的（4 ）包括主要的倒塌无规卷曲。在pH 5.5时 ，占主导地位的构象（溶胶 - PH5集群）上的平均7 +-5 也被采纳，同样包括A -发夹，类似于溶胶p h 9 簇的。其余的构象群显示了低人口值（ 90%)是无序的。这是符合CD的二级结构，证实 -钢绞线的存在，无规线圈和转动元件在两个pH值下（表1），与在pH为9的主导簇（9）相比， pH值5.5 （7）的更高百分比表明，该肽是仅略微更刚性结构在前者的pH ，符合从图3A的直方图的检验得出的结论。 图 5.(A) 的 -MSH 的距离 (n m) EE 的直方图吸附在 p h 值 9 和 p h 值 5.5 的表面。代表性的结构是嵌入。误差线指示的均值标准误差。（B、 C）最高居住于构象后表面吸附在 p h 值 9 (B) 和 5.5(C).在括号中的数字表示，时间的平均百分比结构存在（下划线部分）的轨迹和不确定性用标准误差来表示。分数说明独立运动轨迹 （共 6）显示了各自构象的数目。 总体而言，在溶液中，-MSH 展品类似的结构和p h 值为 9 和 5.5 的动态。3.5. MD 的 -MSH 在疏水表面上的模拟 我们已采用 MD 获取进一步的深入了解分子水平行为的 -MSH 在 PLGA 的表面，作为实验由 QCM 和上述的红外光谱中观察到。这些见解是重要的理解优化的-MSH，这将有助于层状材料-MSH的发展。建立六个独立模拟，如上所述，使用不同的初始肽构象和模型疏水表面。 -MSH 结构和动态严重影响了疏水表面吸附的特点，可能由直方图显示的EE 距离作为肽的单体溶液和后表面吸附。这些由图 4A (pH 9) 和图 4B (pH 5.5)所示。这些直方图显示的数量这两个 pH 值吸附后的扩展构象大幅度增加。特别是充分扩展结构，其中的端到端的距离 3 毫微米，出现了表面吸附 ；在溶液中，这种高度扩展的结构是可以忽略不计的，可以看出在图4.也有并发、 大幅度减少的紧凑结构的 EE 0.5 和 1.7 毫微米之间的距离。 在pH值为9时 ，仍有吸附后（ EE的距离 0.7 n m的强烈倾向于紧凑型构象; 5 （ 2 ） 。因而，表面直方图展览性质相似的溶液直方图 （图 4A）。与之形成鲜明对比的是，在 p h 值 5.5 时（图 4B），平衡极大地转移后吸附、 与优先采用的肽扩展结构的 EE 长度2.2 毫微米 （5 （1%），而不是首选中溶液（0.7 n m）的更为紧密的发卡结构。 在吸附诱导肽pH依赖性结构的差异的变化，可能通过直接的COMPAR进一步阐明的EE距离直方图和构象群的ISON表面吸附系统在两个pH值的影响。 EE距离直方图吸附的肽在pH 5.5和9如图5A所示。两个直方图的检验表明在构象种群显著pH依赖性的差异系统蒸发。特别在pH为9时 ， -MSH具有朝向一个偏置紧凑的结构，通过在 0.7和1.1 n m处的峰所示（ 5（1分别和3 （0.5 ）。与此相反，在pH 5.5时，吸附肽强烈支持更多的扩展构象，由峰在 2.2和3毫微米（5 （2和2 （如上0.5 ，分别）。不同的峰在2存在下如直方图显示，肽偏重某些离散状态，整个轨迹在它们之间转换。pH值9时直方图展示略窄峰，建议稍微更大的结构刚度在该pH时 。这是还观察到在溶液中的肽，如上面所讨论。 聚类分析进一步阐明主导表面-在不同 pH 值的吸附的结构。在 p h 值为 9时，主群集 （冲浪-ph9-群集）中显示，平均来说，27 +-12%轨迹 (图 5B) 的时间。此群集包括结构紧凑、 无序发夹，与有限的 -钢绞线的内容。其余群集有人口 12%和同样拥有有限的二级结构的内容。Ph 值为 5.5时，具有最高的人口群集出现，平均为24 +-0%的时间，（冲浪-ph5-群集 ；图 5 C）。这种结构是瘦长的，扩展部分的组成有利于右转一个急转弯处的甘氨酸，这有利于赖氨酸的多肽主链之间的氢键-缬氨酸与苯丙氨酸-色氨酸。其余的集群有为 4.5，人口由无序扩展的股（数据未显示）在表面上，而相比之下，在肽溶液中，在任一pH值时形成了无 -发夹结构。此外，与稍微多人口高度密集的形成相比， pH为5.5 （24）的状态，在pH 9 （27 ）显示了更大的刚性动感，一致在pH值9 EE距离直方图的窄峰（图5A）。 主要构象的变化之间的显著的差异表面吸附 -MSH 在研究了这两个 pH 值可能有重要肽之间的相互作用的影响和疏水性表面，以及随后的吸附分子的多-发展中的层层大会期间的层状的材料。第一，在 p h 值 9时、 肽保留结构后吸附于表面 （以平均压实度回转半径 R g = 0.85(0.04nm)，而在pH为5.5时，多肽强烈倾向于扩展构象 (R g = 0.96 (0.04nm）。因此，在 p h 值 5.5，每个肽扫出更领域表面上看，增加其有效的大小，从而减少了可作为单层吸附的多肽的总数相比紧凑构象 p h 值为 9 的青睐，启用更多肽以单层吸附。这可能是如部分解释 p h 值为 9，加载的高肽由 QCM 数据收集作为函数的 p h 值 (图 2)。第二，p h 值为 9 肽的略有更大的结构刚度可能会导致更高均匀性的构象，从而导致残留物 （特别是基本残留物），稳定的演示文稿，这可能与任何随后分层分子，从而促进多层膜沉积有利地进行交互。Ph 值为 5.5时，多肽经历了稍多的结构性波动，这可能会使它分层分子寻求更多难出，与多肽构象最适于绑定中已存在交互。第三，它是可能的构象的肽本身可能会影响效果它使随后的分层分子吸附。这个探索 （3.6 层由层大会）在下文将进一步进行。要进一步借洞察的残留-具体方式其中-MSH 的交互方式与模型疏水性表面和有关解释为什么吸附导致较长的构象，我们审查了的条形图表联系人的平均次数是每个残留物和颗粒物的疏水表面 4.5 a 在这两个溶液中的pH 值 (图 6A)。这两种 p h 值为9 和 5.5 获得了性质相似的联系配置文件。有一般较低数量的表面，亲水性或小的疏水性残基(丝氨酸、 甲硫氨酸、色氨酸，甘氨酸和 丙氨酸)之间的接触。其中最显著的接触点形成与芳香族氨基酸色氨酸、 甲硫氨酸、俌氨酸,甘氨酸和缬氨酸，这可以看出可视化的轨迹，表明有的一面链形式密分参切接触为所有表面表面吸附系统研究。中显示了一个示例图 6、 抗坏血酸与 D.All 带电的侧链形式在表面接触。有趣的是，尽管它是带电的，赖氨酸使得与通过水电-非极性表面的接触碳部分其侧链 (图 6)。因此，它是部分由表面屏蔽和可能不参与在进一步切换图层分子的相互作用。另一方面精氨酸形式可以忽略不计与表面接触和完全是相反溶解，指着远端于表面的平面 (图 6)。此外，精氨酸展品中的最高溶剂可接近表面(图 6B) 的区域。因此，精氨酸可用以形成进一步的相互作用，并且可能比赖氨酸更重要，为后续的初始结合的带负电的官能团分层分子。 表面接触型材在两个pH值下研究的主要区别是和组氨酸在pH值为5.5 的低数目标记，在这个pH值下是带电的（带星号的图6A）。与（三重接触的损失质子）组氨酸可以在较低吸附时起到部分作用，装载的- MSH对疏水性表面在pH5.5 时（如PLGA）（图2）。我们注意到，带正电荷和负电荷的表面，所述肽显示了微不足道的接触面（正面除了精氨酸（负上表面）或谷氨酸面）（数据未显示）。这与缺乏一致作为由QCM决定的HA和CS与- MSH的复合物（图1）。我们注意到，有积极和消极电荷的表面，所述肽显示了微不足道的接触面（正面除了精氨酸（负上表面）或谷氨酸面）（数据未显示）。这与缺乏一致作为由QCM厘定HA和CS结合- MSH（图1） 。 我们的仿真程序作为模型的 -MSH/PLGA 的一个限制绑定是的极地乙交酯组，也忽视预期将出席在表面。虽然 PLGA 75： 25表面受雇于我们当前的实验 (见第 2.1.1 条)都可能包含的 （非极性） 丙交酯，很大程度上与多肽表面具有约束力，因此由疏水性主导之间的相互作用，相对较低的分数多肽的绑定到在极地表面仍可能层层进程作出贡献。在亲水地区肽绑定行为也可能明显不同，在疏水区域。这种差别是因为特定的各向异性性质的极地交互 （例如，氢债券，陈列强方向性），而不是各向特异性、非特异性的性质疏水性相互作用。 图 6.(A) 图为平均每个之间的联系的条形图残留 （x 轴） 和表面的原子，带误差线，指示标准获得六个自主-轨迹的平均价值的错误p h 值为 9 和 5.5 的凹痕模拟。(B)图为平均溶剂-的条形图及表面积 (SASA) 为每个后表面吸附的残留物。(C) 图为pH9时典型表面吸附构象的插图，从海拔沿对角线相对于曲面查看（D)沿曲面与侧链的平面窗体中的显示和标记。 有几个不同之处可能为极地地区。-MSH可能要结合后极性表面区域横向少移动。减少横向运动已被证明在模拟通过SERR等人的研究。 ，谁表明的强制运动肽对极性表面呈现滑坡行为，其中的肽在转移一个离散的，逐步的方式在表面上的位置，由于断裂和重新形成氢键。与此相反，在疏水性表面上的运动被示更光滑。也有可能是在肽的差异结构和内部动力。 Roach et al等人观察到，蛋白质吸附时表现出更大的二级结构极性表面相比，憎水表面，还研究了计算的效果。因此，我们推测， - MSH可保留在吸附更多的-链内容到极性表面，与在EE距离直方图更窄峰。这也可能是不同的残基（特别是极性和带电残基） - MSH将绑定到一个极性表面。相比一个非极性的表面，从而暴露不同的组与层层分层分子随后的互动。特别是，虽然组氨酸使得具有疏水性接触表面在pH为5.5时，由于其电荷，因此预计使肽更强烈结合的极性表面在该pH 。该部分- MSH结合到极地表面区域，预计要小，但是，由于只有25的表面，它是基于在此所用的PLGA的单体比（75:25）来影响研究。下部装- MSH在pH 5.5相比， pH值9（在上面的3.2节中讨论）表明，该肽主要是吸附在PLGA表面的疏水区域，与乙交酯基团扮演一个相对次要的角色。 而更如实地表示非晶 PLGA 表面的发展是值得进一步研究的，我们的模型表面不会为此系统提供一些重要的-MSH的视野。首先，正如上述，PLGA 膜和丙交酯微球在目前工作中的使用包括：乙交 以75: 25 的比例。因此，PLGA 表面都可能包含很大程度上的 (疏水性) 丙交酯。也有证据是将分离与浓缩的 ch3 在薄膜 PLGA 表面准备通过溶剂铸造所讨论.，虽然这种影响由表面减毒润湿。此行为被预期行为，适用于2D的PLGA影片在石英晶体微天平研究中使用，但可能会偏离在 PLGA使用乳化技术生产的微球。这种聚乙烯醇微球有由于具有轻微的负面潜力，虽然这预计会将PLGA 降低薄膜的天平使用溶剂铸造方法用于实验。此外，确切的非特异性蛋白结合到 PLGA 上表明的相互作用主要是疏水 作用（例如，之间暴露核心残留物中添加表面） ；事实上，我们以前也曾有所示的 -MSH 细菌吸附在 p h 值为 5.5的上面，PLGA 膜上最可能由于疏水性相互作用。因此，主要的蛋白质之间的绑定模式 / 多肽和 PLGA很可能涉及非特异性、 疏水性之间的相互作用，其中好的我们的模型捕获。3.6.层的层的程序集-MSH 采取行动的能力作为构建基块和初始层的图层，图层材料包括HA和 CS 分子使用 -MSH 涂层 PLGA 膜进行了评估。-MSH 肽是吸附从在 p h 值 9 或 p h 值 5.5 ，测试假设的解决方案为，质量大的 -MSH 遵守 p h 值为 9 的天平，并且更有利的方向由 MD 模拟预测。这种情况会与成功沉积的图层的p h 值为5.5时形成对比 。 静电和疏水性作用作为介绍随后的顶部图层的手段，对-MSH 涂层表面进行了探讨，描述在这里作为切换图层，适当其作用在开关作为大会向医管局和 CS 聚电解质图层。三个开关图层被选择： 两性离子型脂质DOPC，负电荷脂质混合物在比率 DOPC /DOPS是4： 1，和负电荷线性多糖壳聚糖。DOPC /DOPS 比率制备是选基于其白炭黑等各种表面上的能力形成稳定支持脂双层。图 7 所示了三个组件的生物分子的化学结构。 图 7.DOPC、DOPC 和壳聚糖使用的化学结构作为切换图层中的顶部建造，在多层程序集-MSH 涂层 PLGA 曲面。 脂质切换图层被选择进行交互疏水性残留 (甲硫氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸) 的 -MSH 肽。DOPC 充电的DOPC、DOPC混合物也可能使用与壳聚糖和CS 的分子随后分层，每两个血脂 (18 的碳烷烃链的链长在第九个碳位置的双键) 被选择，使血脂有类似疏水性。与之相反，HA是与每个一个羧酸组弱聚阴离子p h 值为 9 和 5.5 中，选定要利用可能的双糖单位与 -MSH 正电残留的交互(A精氨酸、 赖氨酸) + 1 和 + 2 在净电荷而分别令p h 值 9 和 5.5。带正电的CS由于像收费的 CS 和 -MSH 的分子，因而未研究，预计将抑制他们的相互作用，并防止形成一个稳定的图层。 多层膜被成功地运用构造后的 p h 值为 9，-MSH 层的三个开关吸附图层如图 8，那里的 -MSH 大量吸附 (70 (所示30ng/cm) 是类似于相同的条件下在图 2 中观察到的。所有的测量显示出类似的趋势，因此唯一变化的频率和消能显示第三泛音。这些结果显示是很短的，如 -MSH 肽可以用作基地构建基块分层的程序集的施工。大量的切换图层的 -MSH 层被不同运用后立即存入，三个开关的筹备工作（图 8BD) CS的薄层生长也是他们的之间治疗方法，而且是在每个情况下，类似的报告表明相对线性CS 的 PLGA 膜条件下的多层膜是关闭的。 负电荷的脂质 DOPC /DOPS混合物引起了切换图层 （图 8B 中最高的质量沉积到用的 13 + 5 Hz)，对应于 0.3 (频率变动0.1nmol / 厘米 (240 + 90ng/cm) 的脂质时被吸附在 p h 值为5.5.The 整体层的规模也是最大的(4030(270ng/cm)，由于医管局和 CS 层更多大众。Ph 值 5.5 的是选中的交换层沉积，作为上完满的丝氨酸头组有一个净负电荷根据这些条件 ；-1 此 p h 值也是随后的HA和 CS 层沉积的最佳的PH。 图 8(A)显示在-MSH 涂覆的脂质、CS、以及HA的多层大会上，第三次泛音的累积频率的变化PLGA 膜由 QCM 认定。-MSH 肽被吸附p H 值为9。分子 X 是指 DOPC/DOPS混合物的交换层(黑色)，CS（白色）或 DOPC （灰色）。DOPC 被吸附在 pH 9，那里作为CS或DOPC 、DOPS混合物被吸附在 p h 值 5.5。随后的所有图层被装配在 pH 5.5.每个数据点是平均 +_s.d (n = 4 为 DOPC / DOPS，CS，n = 3 = 6的为 DOPC)。（B、 D）在更改频率 (比较) 和耗散 (锦纶) 在第三次泛音显示的 (B) DOPC /DOPS，(C) CS，和 (D) DOP S，-MSH 涂层表面微天平来衡量，脂质体的破损用箭头表示。 高吸附后可能会导致 DOPC/DOPS从更大电荷的相互作用，带正电-MSH 层和负电荷的脂质DOPS，相比于其他的切换图层。这一发现是在与先前的研究报告互动 -MSH 和负电荷的脂质 DMPG 是一致的。其余的解释是 DOPC / DOPS混合物形成双层。图 8(B )显示，加入脂质体，几乎立即显示频率是减少的，脂质体将绑定到表面。其次是增加的频率和相应的减少散热 (如由图 8B 中的箭头所示）。埃嫩可以归到脂质体的双层类脂膜，造成以前所含的水损失内脂质体。多肽之间的相互作用和DOPC 可能进一步稳定DOPC/ DOPS双层形成，据以前的报道，-MSH 与 2-肉豆蔻-有机酸- (DMPG)脂双层和这可以进一步促进分层。 使用CS作为一个开关分子相比 DOPC/DOPS混合物来说导致较少的大众沉积，与铜变化的频率相比，当吸附在-MSH 层的p h 值为5.5时，如图 8所示。相对较高的标准偏差可能是由于少量的材料被存放，这就会引起对大的可变性。随后的HA和 CS 的增长图层是最初类似于为 DOPC/DOPS的，但后 10 层最