愈伤组织制作实验.doc

摘 要水稻成熟种子具有细胞全能性。本实验以+2,4-D为基本培养基，添加NAA和6-BA为分化培养基，对水稻种子材料进行体外培养，诱导形成愈伤组织，并进行分化。在培养基中添加一定量的激素给种子形成愈伤组织提供动力。结果表明，在合适的培养条件下愈伤组织的分化程度很高，但培养基因素或光照条件使得褐化现象严重。关键词 水稻成熟种子 组织培养 愈伤组织 诱导 分化 激素 1前言细胞工程是指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，按照人们的需要和设计，在细胞水平上的遗传操作，重组细胞的结构和内含物，以改变生物的结构和功能，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。其常用技术手段有植物组织培养，植物体细胞杂交、动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体、胚胎移植、核移植等。根据细胞类型的不同，可以把细胞工程分为植物细胞工程和动物细胞工程两大类。本实验主要综述细胞工程中植物细胞工程的植物组织培养这一技术手段。植物组织培养技术的应用范围包括快速繁殖、培育无病毒植物，通过大规模的植物细胞培养来生产药物、食品添加剂、香料、色素和杀虫剂等。植物组织培养，诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织在分化形成植物体。在植物组织培养中，由于植物细胞具有全能性，即植物的体细胞具有母体植株全部遗传信息并会发育成为完整的个体。因而，每一个植物细胞可以像胚胎细胞一样，经离体培养再生成为植株。随着细胞工程技术的不断发展，植物细胞和组织培养这一细胞工程技术也无例外地得到发展，目前已在许多植物上，特别是在农林生产实践中得到了广泛应用。尤其在林木优良品种和无性系的快速繁殖方面进展较快。本实验旨在利用NAA和6-BA的组合调控来诱导水稻成熟种子的愈伤组织，加深对外植体消毒、接种的无菌操作技术，学习外植体愈伤组织诱导的方法。6-BA为细胞分裂素，主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生。如果超过0.1毫克就会抑制发根，超过0.5毫克则完全不发根。NAA是广谱型植物生长调节剂，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根。2,4-D是一种人工合成的植物生长激素。2实验材料、仪器设备及用具、试剂及培养基2.1 水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）；2.2 仪器设备及用具2.2.1仪器设备超净工作台培养室2.2.2用具（每组5人用量）量筒：100ml2培养皿：9cm1三角瓶：50ml2(无菌)，1000ml1枪形镊：4无菌滤纸：（10cm10cm）52.3 试剂及培养基2.3.1试剂 75%酒精，2% NaCLO，无菌水(每组1瓶400ml) 2.3.2 培养基 1、诱导培养基：N6+2,4-D2mg/1+蔗糖30g/l+琼脂8g/l 2、分化培养基：N6+ CuSO45H2O 1.25mg/l+BA 2mg/l+NAA 1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l3 实验步骤3.1接种室、培养基及用具表面消毒 用75%酒精棉球试擦超净工作、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。3.2消毒剂的配制3.2.1 75%酒精：每组配95ml。量取95%酒精75ml，加蒸馏水至95ml即可.3.2.2 2%NaCLO：每组配100ml. 0.5%100yX=(ml) x：应吸取的NaCLO原液的毫升数；y：NaCLO原液的有效氯浓度。3.3种子去壳用自制的脱壳砂纸脱去谷壳，注意保持胚完整。每人准备30粒去壳种子。3.4外植体消毒（以下工作在超净工作台内进行）将米粒放入50ml无菌三角瓶无菌水洗一次弃水，倒入75%酒精，搅拌，30秒弃酒精，倒入2% NaCLO，不时搅拌，30分钟弃NaCLO，用无菌水洗3次，每次停留1分钟倒去无菌水，种子放在带无菌滤纸的培养皿中吸干。3.5接种与观察愈伤组织诱导将吸干的种子接入培养基，注意使胚朝上。每瓶接10粒，每人2瓶。写上日期、接种人、放入培养室25暗培养。1周后调查计算污染率，2周后调查计算愈伤组织诱导率。接种的总种子数污染率(%)=100污染的种子数接种的总种子数诱导率 (%)=100 100形成愈伤组织的种子数数组诱导率 (%)=织的诱导 3.6愈伤组织的再分化观察 无菌条件下将诱导获得的愈伤组织（从约3周后安排此实验），从原材料中用镊子剥离后，接种到分化培养基中，每瓶接种3粒，每个同学接种3瓶，其中一瓶接种对照愈伤组织。后置于光照条件下控制培养（25，2000lux每天光照10小时下培养），观察分化出苗的状况（一般需要2-3个星期的培养时间）。1个月后调查计算分化率。接种的总块数 分化率(%)=l00分化植株的愈伤块数4 结果与分析4.1 实验结果 表一 愈伤组织诱导实验结果 观察日期小组成员 10月29日11月6日110发芽+皿壁霉菌10发芽+皿壁霉菌+1发芽并染菌27发芽8发芽110发芽10发芽28发芽9发芽39发芽+余1不发芽且染菌染菌16发芽7发芽28发芽9发芽18发芽10发芽26发芽7发芽17发芽+ 2不发芽且染菌+1不发芽7发芽+ 2不发芽且染菌+1不发芽28芽+ 1发芽且染菌+1不发芽8芽+ 1发芽且染菌+1不发芽 表二 愈伤组织的再分化结果小组成员 试验结果1生根+2褐化2生根+全部褐化对照染红酵母1生根+全部褐化2+对照染红酵母对照染红酵母对照染红酵母对照染红酵母1生根2染菌对照染红酵母对照染红酵母对照染红酵母注：1、表中对照为接种了对照愈伤组织的三角瓶。2、实验要求为每人接种三个三角瓶，其一为对照。然而我组成员接种的对照组过多是由于愈伤组织的诱导培养结果不明显，因此改为全部或部分接种对照的愈伤组织。4.2实验结果分析4.2.1愈伤组织诱导小组成员(一周后)染菌种子(二周后)形成愈伤组织的种子接种数陈美玲10020204陈小燕10330204310黄文欣10020200李佶10520203李佳凝12020210合421110分析说明：1、污染率的计算中，仅把一周后观察的染菌种子列入计算，并未考虑染菌的扩散；由于实验操作不当导致的皿壁染菌也未计入。2、形成愈伤组织的种子数并不确切，这是由于小组成员们第一次诱导愈伤组织形成，尚不能明辨愈伤组织，以致我们本以为没有愈伤组织形成的种子，在清洗培养基的时候进一步分开种子的组织时发现其实是有愈伤组织形成的。因此，诱导率的计算并不能作为准确的实验结果。3、表中所列的是一周后的染菌情况。事实上，培养皿中只要有一个种子染菌，就极有可能整个培养皿的种子都被污染。例如皿壁染了霉菌的培养皿，在后期观察中，就看到了霉菌逐渐扩大生长，最终污染到许多种子。4、不发芽的种子，很大原因在于接种的种子本身营养不良等。4.2.2愈伤组织的再分化观察表三小组成员 分化的愈伤组织数接种的总块数陈美玲133233对照03陈小燕1032+对照03对照03黄文欣对照03对照03李佶133203对照03李佳凝对照03对照03合939若不把对照愈伤组织计入，如表四：表四分析说明：1、 对照愈伤组织均来自同一培养皿，实验过程中发现，所有接种了对照愈伤组织的三角瓶都染红酵母菌，说明染菌原因来自原材料对照愈伤组织。2、 若不把对照愈伤组织计入，分化率达85.7%，这说明经过严格的无菌接种，在适宜的培养条件中，愈伤组织的分化率是很高的。但是我组接种了较多的对照愈伤组织，以致过半数的三角瓶内都有红酵母染菌现象。这说明，植物细胞工程实验环环相扣，若是一开始的实验材料有问题，那么接下来的操作都化作流水。因此，在今后的试验中，我们需得吸取经验，严格遵守操作规范。3、 前文提及，我组因未能准确识别愈伤组织，以致多日诱导的愈伤组织在最后清洗时才发现，这也是令人惋惜的一点。若不然，分化率的计算会得到很多的可参考数据。4、 实验结果表明,大部分的愈伤组织都出现了褐化现象。这说明褐化原因不在于个人操作,而是愈伤组织的培养条件出了问题。培养基和外界条件均会影响其是否褐化。因此褐化原因可能是：培养基中没有加入抗氧化剂或光照时间过长、光强过大。5 实验思考5.1 如何降低污染率？整个操作过程要严格遵守无菌操作，如增加消毒时间，接种时要谨慎小心避免空气菌种污染，接种后封口更紧密，最后将其置于一干净环境中培养；观察记录时，要注意拿组培瓶的方式，手要握住组培瓶下方不要握住组培瓶的盖子；发现污染的外植体，要及时清理干净，以免污染其他的。5.2 愈伤组织的形成、愈伤组织再分化与哪些因素有关？培养基成分：无机盐浓度较高, 元素间的比例较合适,营养丰富, 缓冲性强, 且微量元素种类齐全, 可用于愈伤组织的诱导, 有利于愈伤组织的形成.。但盐浓度过高会导致外植体褐变, 不利于愈伤组织的增殖和分化。PH: 培养基的PH 值反应培养基的酸碱度, 直接影响外植体对营养元素的吸收, 大多数植物种类要求pH 值在5.0-6.0 。适当降低培养基pH 值可以降低多酚氧化酶的活性和底物利用率, 从而抑制褐变。碳源：选用合适的糖浓度和糖分, 不仅会提高胚性愈伤组织的诱导率, 改善愈伤组织的质量, 而且可以控制植株的再生途径, 从而提高组织再生的频率植物激素：植物激素是愈伤组织诱导过程中的重要影响因子, 能够诱导细胞分裂的启动、愈伤组织的形成和生长. 常用于组织培养的植物激素有两大类: 即生长素类和细胞分裂素类, 二者的浓度比例不同, 对愈伤组织的诱导结果不同。光照：由于培养基中含有植物愈伤组织形成所需要的营养成分, 无需依赖光和作用, 因此, 光照不是愈伤组织形成的必需条件。光照对于后续培养即愈伤组织的分化、根的发生和胚状体的形成是一个必需条件. 因此需要根据组织培养的不同需求, 及时调整光照强度和光周期.温度：在植物组织培养过程中, 温度可直接影响外植体切口细胞分裂与分化, 过高或过低都会造成不良影响, 导致发育受阻而老化. 温度低于15