2014-5-6 PI法细胞周期检测.doc

细胞周期检测（PI法）一、实验方法原理细胞周期（cell cycle)：是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。G1期：细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。S期：DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期。G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。因此，整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M期。通过核酸染料PI标记DNA,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。流式细胞仪的工作原理：是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其DNA特征。细胞周期检测的原理：PI法是较常见的一种周期检测方法。PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。细胞周期示意图如（图一）所示（图一）二、材料及准备工作1.材料准备试剂、耗材名称品牌货号细胞培养瓶corning6孔板corning10ml离心管国产1.5ml EP管国产胰酶（无EDTA）贝博试剂盒中包括RNase-A贝博试剂盒中包括PI贝博试剂盒中包括无水乙醇国产PBS自配2. 试剂配制10XPBS液体配方（0.1MPBS pH 7.4）以1L量为例： NaCl 80gNa2HPO412H2O 32.3gNaH2PO42H2O 4.5g（十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠）加双蒸水900mL 左右，用HCl/NaOH 调pH至7.4，最后定容为1000mL。使用时用去离子水稀释成1XPBS3.仪器设备流式细胞仪；细胞培养孵箱；离心机；水浴；冰箱；离心管；封口膜；移液器三、 实验步骤及注意事项：（采用贝博公司的细胞周期检测试剂盒）1. 细胞样品的准备： 单次流式细胞仪检测，1份样品细胞数量约106（我校8楼免疫教研室的要求） 收集细胞培养液备用。 用胰酶（无EDTA）消化细胞，至细胞可以被轻轻用吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。 将细胞悬液收集到10ml的离心管内。800g左右离心5min，沉淀细胞。小心吸除上清，残留约50微升左右的培养液，以避免吸走细胞。 加入1ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞， 800g5min。为减少细胞损失可用1.5ml离心。 再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，残留约20ul左右的PBS，以 避免吸走细胞。重复第5步操作，用预冷的PBS再次洗细胞，并离心收集细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团，用250ul预冷的PBS重悬细胞。2. 细胞固定：缓慢加入750ul冰浴预冷无水乙醇，轻轻吹打混匀，4固定2小时或-20固定1小时，封口膜封口（此步可停止，-20保存样品，1周内样品检测不受影响）。3. 染色：1000g左右离心3-5min，沉淀细胞。小心吸除上清，可以残留约50ul左右的70%乙醇，以避免吸走细胞。加入约1ml冰浴预冷的PBS，洗涤细胞一次。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。用200ul预冷的PBS重悬细加入Rnase A溶液20ul，37水浴30min。 每管细胞样品中加入400ul碘化丙啶染色液，缓慢并充分混匀后4避光孵育30 min。染色完成后宜在24h内完成流式检测。. 流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。注意事项1.RNaseA用PBS配制，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。试剂盒中带有配制好的酶。2.流式分析时需要的是单个细胞悬液，因此在操作过程中充分混悬细胞。3.固定过程中不直接加70%乙醇的原因是：直接加入乙醇会导致细胞团聚的现象，很难重悬成单细胞。乙醇固定之后没有细胞沉淀。3. PI液体4避光保存。FlowJo分析细胞周期数据的过程1.把细胞周期样品拖入FlowJo软件，双击打开原始数据。如(图二)所示：(图二)X轴选择FSC,Y轴选择SSC。分析细胞周期的细胞选择上图所示的细胞群体进行分析。2. 在SSC/FSC图中双击分析的细胞群体，如（图三）所示：（图三）X轴选择FL3-LIN,用来表示PI的线性信号。Y轴选择FL3-PEAK,用来表示PI的峰值信号。本实验数据采集采用的是贝克曼仪器采集的数据。（如果是BD的仪器采集的数据，X轴选择FL2-W,用来表示PI的宽度信号。Y轴选择FL2-A,用来表示PI的面积信号），如上图所示多倍体或异倍体细胞不予分析。3.在FlowJo工作台中选中“用于周期分析的二倍体细胞”这个结点，在工具栏的“工具”中选择“细胞周期”。如（图四）所示（图四）说明：1) 分析的模型有Watson和DJF两种，用户可以选择任意一种进行分析，两模型间没有实质的差别。模式右边是两种模型的显示方式。2) 细胞周期拟合原则：G1峰限制和G2峰限制。根据实验结果拟合情况，对G1峰限制和G2峰限制进行适当的调整。曲线调整原则：粉色的曲线为模型曲线，黑色的为样本曲线，理想状况是粉色和黑色曲线吻合一致为最佳。拟和的好坏可以l 根据右边的RMS值来判断。RMS(root mean square)值越小越好。但是这只是一个相对值，只在同样本不同模拟情况下，选取最小值来达到最佳拟和。你可以选中G1期的峰或G2期的峰，根据调节按钮调节峰的宽度l 通常来说，G2的位置为G1的2倍。 你可以根据相对固定的那个峰来确定另外一个峰的位置，如G1峰相对固定的话，就选择G2峰的均数为G1的2倍(2G1)；如果G2峰相对固定的话，就选择G1峰为G2峰的0.5G2细胞周期结果解读：G0/G1期细胞占总的61.2%，峰位于横座标的45.76G2/M期占13.07，峰位于横座标的91.43S期占25.73G2/G1为2.0（即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为2）峰的变异系数为4.54%（好）细胞碎片为0.48%，细胞聚集体有0.06%。总的细胞数（仪器检测到的）为17525个，在细胞周期中分析的细胞数为17431个（即排除了碎片及聚集体后）CV是变异系数。一般CV越小，峰形越好，越尖锐。能控制在5%左右是比较好的结果，一般小于10%就可以认可了。细胞周期分析常用术语： CV：变异系数。不同细胞群体DNA含量的细微差别可能有生物学上的重要意义，因此DNA含量的流式分析中分辨率尤其关键。通常检测分辨率或精度由G0/G1峰的CV来反映。影响CV的因素主要包括两方面：仪器因素和样品制备及染色过程对标本的人为影响。 Ploidy:倍体。原指染色体数目。流式中用来描述总的DNA含量。二倍体细胞有正常细胞的DNA 含量但不排除染色体的异常。S期含量 :S期细胞占总细胞周期的比例。细胞周期数据结果输出1. 细胞周期结果的输出根据最终的需求可以有多种输出方式 在细胞周期分析窗口工具栏中选择“文件”并