补体参与反应 T细胞数量及其功能检测.ppt

实验三补体参与的反应T细胞数量及其功能检测 PartI补体参与的反应补体的溶血反应PartIIT细胞数量及其功能检测E花环形成试验 数量测定淋巴细胞转化试验 形态学方法3H TDR掺入法MTT比色法 功能 PartI补体参与的反应 复习 1 补体的溶血反应 原理绵羊红细胞 SRBC 作为抗原与其相应抗体 溶血素 结合后 通过经典途径激活补体 产生膜攻击作用 最后导致红细胞溶解 发生溶血反应 材料1 抗原 2 绵羊红细胞 2 抗体 溶血素 3 补体 健康豚鼠新鲜血清4 生理盐水 24孔板等 步骤 1 取24孔板 按下表加入各成分 2 将24孔板放在37 温箱内15 30min 观察并记录结果 结果 PartIIT细胞数量及其功能检测 2 E花环形成试验 原理人外周血T细胞表面具有天然的能与绵羊红细胞 SRBC 表面糖肽相结合的受体 E受体 CD2分子 可结合SRBC形成花环样细胞团 是T细胞特有的表面标志 检测T细胞数量 间接判断机体的细胞免疫状况 材料肝素抗凝血 绵羊红细胞 SRBC 淋巴细胞分层液 Hank s液 1640培养液 0 5 戊二醛固定液 灿烂甲酚兰染液试管 滴管 离心机 微量移液器 玻片 显微镜等 步骤 动作轻柔 分清滴管及枪头 取肝素抗凝血与等量Hank s液稀释混匀血3ml 用滴管贴管壁 倾斜30 轻轻叠加于3ml分离液上 界面要清晰 配平后1800rpm离心13mins 1 淋巴细胞悬液的制备 人淋巴细胞比重 1 070淋巴细胞分层液 1 077人红细胞比重 1 092 另取一支滴管 仔细吸出位于血浆和分离液之间的乳白色的单个核细胞 放入盛有5mlHank s液的试管 2000rpm离心5mins 3 弃上清 倾倒时液体不要回流 将沉淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入Hank s液5ml 重复离心两次 2 弃去上清 留经过洗涤的淋巴细胞悬液 约0 1ml 与绵羊红细胞0 1ml 1640营养液0 1ml混合 分清枪头 轻弹混匀后放于37 温箱15mins 离心时要配平 3 取出试管 500rpm离心5mins 注意此步非常关键 转速一定要慢 一启动即关 来回数次即可 室温静置2 3mins4 吸去100 150ul上清液 轻轻旋转混匀 沿管壁滴加1滴 50ul 戊二醛 轻轻混匀静置5mins 5 取一滴 25ul 液体滴片 加一滴灿烂甲酚兰染液 加盖玻片 6 高倍镜下观察 计数100个淋巴细胞 计算花环形成率 淋巴细胞上结合 3个SRBC者为E花环阳性 正常参考值 EtRFC 64 4 6 7 EaRFC 23 6 3 5 EsRFC 3 3 2 6 结果 SRBC 淋巴细胞转化试验 原理T细胞在体外培养时 受到非特异性有丝分裂原 如PHA ConA 或特异性抗原刺激后 可出现代谢旺盛 蛋白质和核酸合成增加 细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞 称淋巴细胞转化现象 淋巴细胞转化率的高低 可反映机体的细胞免疫水平 故可作为测定机体免疫功能的指标 三种方法形态学方法 3H TdR掺入法 MTT比色法 根据胞核的大小 核与胞浆的比例 胞浆染色性 核的构造与核仁的有无 成熟小淋巴细胞 核染色深 没有核仁 胞浆少 染色为轻度嗜碱性 过渡型淋巴细胞 大于小淋巴细胞 核染色比较疏松 胞浆比较多 但是出现核仁 淋巴母细胞 体积增大 形态不规则 核变大 核质染色疏松 有核仁1 2个 胞浆丰富 常出现胞浆空泡 其他细胞 中性粒细胞在培养72消失后 绝大部分衰变或死亡呈碎片 形态学方法 镜下观察 淋巴细胞转化试验 淋巴细胞转化率 正常参考值 80 红细胞 未转化淋巴细胞 转化的淋巴细胞 淋巴细胞转化实验瑞氏染色10 40 3H TDR掺入法 淋巴细胞转化试验 T细胞受到PHA或特异性抗原刺激后 发生有丝分裂 细胞进入S期 此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷 3H TDR 可以被细胞摄入而掺入DNA中 通过 液体闪烁计数器测定3H TDR的掺入量 判断细胞的增殖程度 MTT比色法 淋巴细胞转化试验 MTT为一种黄色可溶性物质 细胞活化增殖时通过线粒体能量代谢 将MTT代谢成蓝紫色的甲臢 沉积于细胞内或细胞周围 形成甲臢的量与细胞活化增殖的程度呈正比 甲臢经盐酸异丙醇溶解后呈紫蓝色 置于酶标仪下根据显色程度即可知道甲臢量并反映细胞活化程度 MTT Formazan Insoluble 1 补体溶血反应的原理