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原代肝细胞分离培养与方法肝 细胞 的 分离 和 培养 是体 外 组 合性 生 物 人工 肝 研究 的 基础 ，但 单 纯机 械 分离 法 对肝 细 胞损 伤 较 大 ， 分离 后 的肝 细 胞体 外 培养 的 难度 亦 较 大 ，方 法 复 杂 ， 成 本较 高 体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞. 1 非 酶 分 离 细 胞 法 11 直接 分离 法 ：麻醉 或处 死动 物后 ，取 出肝脏 ，剪成 小 块 ，通过机械 方法(挤压 、剪碎 、震荡 、吹打)得到 单个细 胞 ，多 与 EDTA螯 合法 、灌 注法 相结合 ，即先 用 EDTA溶液 进行 充 分 的灌流 ，再剪成组 织小 块 ，然后 用各 种 机械 的方 法 分离 得 到肝细胞 。该方法 操作 简单 、流程 短 ，不 需要 复杂 仪 器和 昂 贵 的胶原酶 。但实验操作 对细胞 的损伤 大 ，尤 其是造 成 细胞 表 面蛋 白不 可逆 的机械性损伤 ，导致 细胞 的获得率 和存活 率 较 低 。 12 组织块培养法 ：用麻醉剂 (乙醚 、戊 巴比妥纳等 )将 动 物 麻 醉 或直 接 断 头 处 死 ，取 出 肝 脏 ，用 缓 冲 液 充 分 洗 涤 后 ，剥 离肝被 膜 ，将 其 剪 成 1 mm。的 组 织 小 块 ，充 分 洗 涤 后 ，以 05 cm的间隔接种 于培养器皿 中(25 m L的培养 瓶 中可接种 3O块 )，先 加 入 少 量 的 培 养 基 ，静 置 培 养 12 24 h后 再 加 入 足量的培养基 。该操作过程 短 ，污染少 ，损伤 小 ，细胞成 活率 很 高而成本低 。但纯度不高 ，且 形成 典型上 皮细 胞层所 需时 间 较 长 ，在 细 胞 爬 出 后 还 需 剔 除 组 织 块 ，易 造 成 二 次 污 染 。 可能是因为成年动 物 的结缔 组织 比新 生动 物 的结缔 组 织致 密 ，肝 细 胞 难 以迁 出 ，故 此 法 多 用 于 1 6 d的新 生 动 物 或 动 物 胚 胎 。 2 离体肝脏 酶消化分离法 21 胰蛋 白酶 、胶 原酶 消化 法 ：麻 醉 或处 死动 物后 ，取 出 肝脏 ，用 缓冲液充分洗涤后 ，剥离肝 被膜 ，将其 剪成 1 mm。的 组织小块 ，充 分洗 涤后 ，在 37下 用胰 酶 或 (和)胶 原 酶 消 化 ，待消化物成蓬松 的絮 状物 后加 入 培养 基终 止 消化 ，吹 打 均匀后经 200目不 锈钢 网筛过 滤后 ，离心 、重悬 即可 获得肝 细胞 。胶原酶 只消化 细胞间质而对 肝 细胞机 械性损伤 较小 ， 也能较完整地 保存膜 蛋 白7，分离效 果好 。肝 细胞产 率 高 、 损伤小 ，且保持特异性功能 的时间长 。但 胶原酶 价格 比较 昂 贵 ，成本高 。胰蛋 白酶既 消化 细胞 问质 又消 化细 胞本 身 ，操 作简单 ，价格便宜 ，但胰 酶消 化 的条 件极 难 把握 而使 该法 未 被 广 泛应 用 L89_。 22 胰蛋 白酶 、胶原 酶 消化 的组 织块 法 ：处死 小 鼠，无 菌 分离肝脏 ，置 D-Hanks液 中，冲洗肝 脏 至灰 白色 ，将 肝脏 剪 成 1 mm。的组织块 ，在 37下用胰 酶或(和)胶原 酶消化后 ， 加人培养基终止消化 ，自然沉降后 ，取下 层组织 块 ，再 用培 养 基洗涤数次即可将肝组织块贴壁 于培养瓶 中 ，每个培养瓶放 组 织块 3035块 ，加少许培养基 。该法分离效果 、纯度较单 纯 的组织块法好 ，且细胞从组 织块爬 出时 间相对短 。但消化 酶的用量和时间不 易控 制 ：消化过 度 ，形 成 的絮状 组织 块 不 能分离 ；消化不充分 ，酶没有发挥其作用1012。 23 在 体 肝 脏 酶 灌 注 法 231 Seglen灌 注法 ：即经 典 的二步 胶 原酶 灌 注法 。两 步 灌注 即经 门静 脉以无 钙缓 冲液 和胶 原酶恒 流 、恒 温灌 注 ，这 是 目前 国际上公认 的方 法。首先用 不含 Ca 的离子 螯合 剂 (EDTA等)移走肝组 织中的 Ca ，从而打破 固定 细胞 的细胞 桥粒样结构 ；再用胶原 酶进 行蛋 白分 解 消化 ，最终 使纤 维 组 织 网被消化 ，细胞间连接被解除 ，再经 反复离 心分离 ，即得 到 肝细胞悬液 。有 报道 肝灌 流的途径 除 了门静 脉外 ，还有经 胆道 、腹 主动脉 等多种 途径 。 则认 为二步灌流法分离肝 细胞 的关 键是把 握两个 Ca。 的 浓度 和 两个温度 。两个 Ca。 的浓度是指预灌 流液和灌 流液 中 Ca 的 浓 度 ，为 了肝 细 胞 的最 终 分 离 必须 用 EDTA 溶 液 进 行 充 分 的预灌 流 ，其 冲走 了 Ca 依赖性 的黏 附分子 ，进而 引起半 桥 粒 的分 开 ，同时胶原酶 是一种需 要 Ca 活化 的酶 ，胶原酶 消 化 时需 含 一 定 的 Ca。 (5 mmolL)；两 个 温 度 是 指 胶 原 酶 消 化 时的温度 (37)和纯化 时的操 作温 度 (4)。该法分 离 效果好 ，一次能获得大量肝细胞 。细胞活力好 、存活率高 ，培 养易成功并 可分离 出肝 实质细胞及肝非 实质细 胞 (如星状 细 胞 、SE21细胞 等)，是 肝 细胞 实验 研究 的理 想灌 注 方法 。但 操作繁琐 、流程长 、技术要求 高 ，需要 恒流循 环灌注 装置和 消 耗 大 量 的 胶 原 酶 ，并 且 易 污 染 。 232 半原位胶原酶灌 流法 ：有学者 在原位 灌流 法 的 基础上 建立 了半 原位 灌 流法 。苯 巴比妥 钠麻 醉 成年 SD大 鼠 ，肝 素钠 肝 素化 ，门静 脉插 管进 行 灌流 ，用 EDTA 溶 液灌 流 ，之后剪下肝脏 保 留 门静 脉 ，再 以含 型胶原 酶 的 Hanks 溶液灌 流 ，之后去除肝被膜及 血管 ，钝性撕裂 肝组织 ，加 入培 养基 ，制备单 细胞 悬 液 ，多 层 纱布 过 滤 即可 得单 个 肝 细胞 。 该法与 Seglen法 比较有 以下优 点 ： 以普通 的一次性输 血器 替换 了恒 流泵装 置 ，通过旋钮控 制输注 速度 ，其调节 方便 ，流 量均匀 ，解 决了蠕动泵安装复杂 、间断性 灌流 的难点 ；此 法 胶原酶的用量仅为 Seglen法的 14；流程 短 、操作简便 而且 不需要特殊设备 。但操作过程也容 易产 生污染 。 （体 外原 代 肝 细胞 分 离培 养 方 法 的 比较 徐雅 玲 综述 黄 巨恩 刘华 刚 审校 ）目前采用的Seglen门静脉两步灌流法及其改良的方法,分离大鼠原代肝细胞，并联合应用percoll单密度梯度离心法进行纯化，所得细胞数量多，活力好，纯度高，并且保留了肝细胞的各项功能。该方法也存在操作复杂，技术要求高，所需时间长，易污染，经济成本高等缺陷，限制了原代肝细胞在研究中的广泛应用。为了改变这些方法的瓶颈点，有关学科的学者们不懈的探索着简单易行、经济实用的小鼠原代肝细胞分离纯化方法来为进一步的相关研究奠定基础。1、聂兴草的一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法 试剂：D-ha nk s 液 ; 消化液 : 含 1 g / L 胰蛋白酶、 10g / L 聚乙烯吡咯烷酮 ( p olyvi nyl py ro li do ne, PV P)及 0. 3 g /L EDTA ;消化液 :含 2 g /L胶原酶及10 g / L PV P; 基础培养液为 DM EM , 另含青霉素100 u /ml、 链霉素 1 00 g /m l、 50 m mol /L HEPES、30 g / L 谷氨酰胺 ; 小牛血清 ; 培养基内其他因子: 胰岛素 5g /ml、转铁蛋白 5g /ml 、 促甲状腺素 释放因子 10- 6mol /L、促肝细胞生长因子 20 g /m l、 氢化可的松 10- 6mo l / L)。方法：断头处死动物无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。 肝组织用 4 D-hank s液或不含 BS的培养液洗净血污 , 剥除包膜及纤维成分 , 将肝组织切为约1 mm3小块 , 再用上述液体尽量洗去残留血污 , 最后一次清洗后 800 r /min离心 4 min, 弃上清 , 加入消化液 , 37孵育 12 min, 再用培养液洗 3次以清除胰酶。将消化好的肝组织块贴于 25 cm2培养瓶中 ,加少许含 100 ml /L BS培养液置 37、 5% CO2条件下 2 3 h 后再补充 6 ml含 100 ml /L BS培养液。 待细胞长出生长晕后改为 50 ml /L BS培养液。1. 4鼠肝细胞单层培养动物和肝组织处理同上 ,加入消化液 , 置 4过夜消化 ,去除消化液加含 100 ml /L BS培养液 ,用滴管轻轻吹打成细胞悬液 , 经 200目尼龙筛网过滤后用培养液洗 2次 , 4 50 g离心 4 min,收集肝细胞 ,台盼蓝活细胞计数 80% ,按 5 105/ml 密度接种 , 于 37、 5% CO2 条件下培养 , 待细胞贴壁生长后改为50ml /L BS培养液。2、 张 娓的大 鼠肝细胞 的分 离及 BRL细胞 培 养 上清 对 原 代肝 细 胞 增 殖 的 影 响主要 试剂 ：型 胶 原酶 、台盼 蓝 培 养 基 为 ，胎 牛血 清 。 主要 仪 器 设备 ：CO：细 胞培 养箱 ， 医用 超 净工 作 台 ，倒 置 显 微 镜 方法：Wistar大 鼠于术 前 24 h禁 食 水 ，以 15 gL 的戊 巴 比妥 钠 溶 液 腹 腔 注 射 麻 醉 (50 mgkg)，尾 静 脉注 射 肝 素 1 000 U，仰 卧位 固定 ，腹 部备 皮 消 毒 ，在 超净 台内 打开 腹 腔 ，游离 门静脉 ，门静 脉 内插 入 软 硅 胶 管并 固定 。 以 37预 热 的灌 流液 快 速灌 流 ，灌 速 3040 mlmin，同 时剪 断 下 腔静 脉 ，约 10 min后 可见 肝 脏 变成 灰 白 色 。离 断 肝 周 血 管 韧 带 ，仅 保 留 门静 脉 ，将 肝脏 移 入无 菌 平皿 中 ，以 37 的 05 gL 的 型胶 原 酶 Hanks溶 液 灌 注 ，灌 速 5 mlmin， 约 20 min。 可 回 收 平 皿 内 的 胶 原 酶 液 ，循 环 灌 注 。 撕 下肝 包 膜 ，将 肝 细 胞 刷 入 预 冷 的 Hanks液 中 ，200 目滤 网过 滤 ，制 成 粗 制 肝 细 胞 悬 液 ，1 500 rmin离 心 3 min，以预冷 的 Hanks液 漂洗 ，共 3次 。 以不 同 的混 合培 养 液 或普 通 培 养 液 重 悬 肝 细 胞 ，台盼 兰排 斥 法 检测 肝 细 胞 活 力 。 以 每 孔 110 个 肝 细 胞 的 密度 接 种 入 24孔 培 养 板 ，于 37 、体 积 分 数 5 CO：培养 箱 内培养 。3、余莹的改良的小鼠原代肝细胞分离纯化方法主要试剂：EGTA ,HEPES ,IV型胶原酶，DMEM-HG培养基干粉，percoll ，碱性品红、高碘酸，Sorvall Legend RT离心机;倒置荧光显微镜;小牛血清、胎牛血清;细胞培养皿、细胞培养板;20 ml一次性注射器，7号输液针。 肝灌洗液I为含EGTA 0.5 mmol/L HEPES 1mmol/L的无Caz、无Mgz的D-hanks缓冲液，I用前将pH值调至7.27.5之间，于37温育。 W型胶原酶溶液用肝灌洗液I配制，加人5 mrnol/L的CaClz, 0.02% IV型胶原酶，用前37温育5 mina percoll单密度(1.070 g/cm)离心液percoll原液90 ml加1.5 mol/L NaCI溶液 10 ml，配成100%的percoll溶液;用PBS稀释100%的percoll溶液至30%浓度，即密度为1.07岁cm3的单密度肝细胞分离液。 肝细胞培养液高糖DMEM,10%FBS,100 U/L青霉素、100 U/L链霉素，10 nmol/L胰岛素。方法：颈椎脱臼法处死小鼠，固定四肢，75%酒精消毒后打开腹腔，暴露肝脏及门静脉;用7号输液针与20 ml注射器相联，排气后门静脉穿刺插管固定;用37预热的无钙肝灌洗液I进行原位肝脏灌注，待肝脏膨起，整个呈土白色，剪断下腔静脉放血;继续灌注时，采用间断法，即快速灌注至肝脏略膨后，停顿5一10 s，待肝窦内残血流出，肝脏回缩后，再进行推注，反复5一10次，至肝回缩时无残血流出;共约2 min;用IV型胶原酶溶液进行原位消化;灌注胶原酶时，先用镊子夹住下腔静脉，至肝脏膨起，然后松开镊子，反复3次。每只小鼠约需5 ml胶原酶溶液。消化2Smin，用镊子压按肝脏，凹陷不反弹时取下整个肝脏，PBS漂洗去除肝脏表面的血渍;于冰上预冷的培养皿中用眼科镊钝性撕碎肝组织呈糊状，加人Sml冰上预冷的含血清DMEM中止消化，涡旋混匀;用移液枪充分吹打分散细胞，于100目细胞筛过滤除去未消化的肝脏组织及结缔组织，所得悬液即为肝细胞悬液。4、杨 天燕的小 鼠 原 代 肝 细 胞 的 分 离 与 培 养主要试剂： 完全 DMEM培养基 ：28 gL(333 mmolL) 碳酸氢钠 ，48 L(20 mmolL)HEPES，5胎牛血清(四季 青)，5 mlL(1 mmoL)L一谷氨酰胺 ，10 mlL(1 mmoL)丙 酮酸钠 ；IV型胶原酶(sigma)，浓度 ：02 ；Dhanks，不含钙 镁 ，(solarbio)；75酒精 。 13 主要实验器材 眼科剪、眼科镊 、手术剪 、烧杯 、滴管 、 离心管 、50 m L培养瓶。 方法：断头处死小鼠，75酒精浸泡 5 S，剖 腹取肝脏 ，放置于装有适量 Dhanks的培养皿，去除血管 、血 污、包膜等 ，转移 至装有 D-hanks的小烧杯 ，剪 碎组织 ，用 D-hanks冲洗 2次 ，转移至离心管，1 000 rpm，离心 5 min，弃 悬液 ，每加入 1 m L V型胶原酶便轻轻吹打I 1次，共加 4次， 即总共加入 4 m L V胶原酶I ，室温消化 15 min，全部过滤至 装有完 全 DMEM 的 烧杯 中，吹打 均匀 ，转 移 至离 心 管 ， 1 000 rpm，再次离心 5 min，弃悬液 ，重新加入 5 m L没有血 清的 DMEM，吹打混匀所得沉淀物，1 000 rpm，离心 5 min， 弃悬液 ，加入 5 m L完全 DMEM，吹打混匀 ，接种至培养瓶 。 15 肝细胞的培养 在接种细胞前 ，预先在培养瓶的底部 铺上一层胎 牛血清，待血清干时即可 ，接种至培养瓶 ，放人 37的 CO 培养箱培养 ，2 d后可见部分细胞贴壁 ，培养到第十天方可在镜下观察到细胞生长，此后，根据培养液的颜色变化开始更换培养基。5、徐雅 玲的体 外原 代 肝 细胞 分 离培 养 方 法 的 比较 试剂、仪器、方法如下：75%酒精消毒后断头处死大 鼠，无 菌分离 出肝组织 后均在 冰 浴下操作 ，肝组织用 4 D-Hanks液或者 PBS液 洗净血污 ， 尽可能 的剥净肝包膜及纤维成 分 ，剪 切肝组织 约为 1 mm。小 块 ，使其 成糊状 ，再用上述液体尽 量洗 去残 留血 污 ，将 组织 小 块转入到 离 心 管 中，加 入 025 胰 酶 消 化 3 min后 ，用 含 10 胎牛血 清 的 DMEMHG终 止 消 化 ，以 800 rmin离 心 5 min，弃上清 ；01 胶原酶消化 10 min，加入培养基洗 涤，充 分吹打 2 min(尽可 能的吹散膨松 絮状 组织块 ，动作应轻柔)， 静置 5 min使肝组织块沉 于离心 管的底部 ，取 中下 23的上 清 于另一离心 管中收集 细胞悬液 ，以1 000 rmin离心5 rain， 弃上清 ，加入含 1O 胎牛血清 的 DMEMHG培养 液重悬 ，台 盼蓝活细胞 计数85 ，调整细胞浓度 以 510 m L接种 于 铺 有鼠尾胶 原的 50 m L培养瓶 内 37、5 CO 、饱 和湿 度 静置培养 。24 h首次换液 ，以后每 2 d换液 ；而对 于第 一支离 心管 ：培养基重悬下层沉淀的组 织块 ，静置几分 钟 ，弃 上层 液 体 ，重复以上操作两次 ，加入少 量含 1O 胎 牛血清 的 DMEM HG的培养基重悬组织块 种瓶 ，而后轻轻翻转培养瓶 ，使瓶底 向上 ，注 意翻瓶 时勿使 组织 小块 流动 ，塞好 瓶 塞 ，置 37温 箱培养 2 h左右 (勿超过 4 h)，使小块微干涸 。而后在瓶底脚 部轻轻注入培养基 少许 ，再 缓缓把 培 养瓶 翻转 过来 ，让培 养 液慢慢覆盖 附于 瓶地 上 的组 织 小块 ，置温 箱 中绝 对 静置 培 养 。直 至 48 h后换液时方可移动或者观察 ，以便 于组织 块贴 擘 。 该法 属于改 良的酶 分离肝 细胞 法 。主 要 的技术要 点 和 依据如下 ：断头处死动物 ，尽量减少肝 组织 内血细胞 量； 冰浴条件下 剥离组织块可大大提 高成功率 ，可能是 由于肝 细 胞在低温条 件下代谢减慢 ，抗 损伤 能力增强 ； 先用胰 酶 ，再 用胶原酶处理 肝组 织块 。因为成 纤 维细 胞对 胰酶 较 肝细 胞 敏 感 ，先 用 胰 酶 消 化 下 来 成 纤 维 细 胞 ，离 心 纯 化 后 再 用 胶 原 酶 消化 ，而胶原酶可有效促 进肝细胞 与胶原 等基质 分离 而不 使 细胞 受损 ，在解 除细胞间接触抑制 的同时 能活化 肝细胞 的 蛋 白激酶 、生长 因子及其受 体 ，促 进肝 细胞有丝 分裂 ，还 可促 进肝非 实质细胞分泌胶原 、蛋 白多糖 等细胞 基质并 在细胞 间 沉积 ，使体外培养 的肝 细胞模 拟 了体 内生 长 的微 环境_ ； 弃 上 13，而 取 中下 23的上 清 收集 细 胞 悬 液 ，可 去 除 杂 质 及 离 心 过 程 中产 生 的 细 胞 碎 片 ； 经 酶 处 理 后 的 组 织 块 ，结 构 松 散 ，细胞 易 于 从 组 织 块 中爬 出 ，且 纯 度 较 高 ； 培 养 瓶 和 培 养 板 的 预 处 理 ，即 用 鼠尾 胶 原 预 处 理 的 培 养 瓶 或 培 养 板 会 使 肝细胞贴壁牢 固，不易丢失 。原位灌注时，门静脉穿刺十分困难，很容易穿破，请问有无穿刺技巧？将门静脉分离出来，再穿刺，成功率会大大提高。小鼠的门脉插管，用血管夹先短暂夹闭门脉，用24G静脉留置针（直型的）插的，下腔我用18G静脉留置针插得，2 我使用的是0.05%胶原酶II，请问要消化多长时间最合适？3 分离的小鼠肝细胞体积太小，只有在200倍镜下才能看清楚，测定细胞活性都很困难，请问这是否正常？4 肝组织经200目筛过之后，离心时发现滤过液中还有些不溶的组织存留，请问是何原因？ 一般用两步灌注法！我用的是0.054型胶原酶，胶原酶2型没有试过！分离的效果很好，细胞的活力在80以上！你的老鼠太小估计在分离肝脏找到门静脉和插管的时候有难度！我的方法是：1.快速分离肝脏，插管！注意切勿弄破肝包膜，否则灌注的时候有漏液，而导致灌注不充分！2.灌注液：第一步用不含钙和镁离子的D-Hanks 含EDTA灌注150200ML，第二步用0.05的胶原酶4型4050ML!（具体的配方我在细胞技术版讨论中已经上传过你可查找）灌注的时间估计在15分钟左右,胶原酶灌注完以后在37度水浴10分钟，时间太长酶对细胞膜还是损伤的！3.用200目筛选后，加入不含酚红的1640基培，低温离心机700RPM 3分钟离心3次！获得细胞可以培养了，多的细胞液可以冻存起来！“肝组织经200目筛过之后，离心时发现滤过液中还有些不溶的组织存留”个人认为是你的细胞消化不完全，或是细胞太稠都聚合成团了！建议你应该稀释细胞，在计数以后再调节细胞的浓度！细胞冻存浓度在56M/ml! 插管是个技术活，但是熟能生巧。我建议你用一下：医用硅胶管，最小号的那种，直接插入（前端可剪成一小斜面，尖端再剪圆），这样不会损伤血管，也好用线扎紧。灌流：两步法。具体同上战友所述。此外，可在膈肌处找到一根很粗的下腔静脉，利用它可以做一个灌流循环！（胶原酶太贵了：）。整套体系可在水浴控温条件下进行。消化时间：可以明显看到肝脏变白、变软，呈现蜂窝状，即可。把粘膜撕开，小镊子轻轻一刮，细胞就掉下来了。细胞大小：我当时用10*10就可以看到，不知道你的为什么会那么小。插管是个技术活，一般非外科医生很难掌握，我们用的是离体分离肝细胞：1.腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉新生中国实验小型猪。常规方法消毒皮肤，开腹，暴露门静脉并注入肝素钠100150U。2.游离肝脏，于肝门处剪下取出，先用前灌流液(含EDTA、无Ca2+、Mg2+的Hanks液)以80100ml/min的速度灌流1015min，再用浓度为0.05的胶原酶液以5070ml/min的速度灌流10min。两种灌流液均保持在3738。3.灌流结束后，用剪刀划破肝包膜，剔除大块纤维结缔组织，收集细胞悬液，酌情再置37条件下消化1015min。用RPMI-1640培养液终止消化，3层纱布过滤，然后50g、3min离心洗涤肝细胞34次，获得肝细胞。最近在分离原代肝细胞，用的是两步灌流法，就是先用灌流液，后用胶原酶灌流消化，然后用200目筛网过滤，50g离心3min，之后用PBS洗3次，也是上面的转速和时间，得到下层的肝细胞，用培养液悬浮，接到6孔板里，然后就有浑浊的沉淀，沉淀是肝细胞，4个小时之后换液，原代肝细胞很容易贴壁生长，4小时肯定能贴壁，将此沉淀用培养液或pbs稀释，加台盘蓝染色，显微镜下观察，若为活细胞，通常就是肝细胞了，要培养好，最好有大于85%以上的活性。（原代肝细胞最好生长在鼠尾胶原上，也就是用鼠尾胶原铺板，然后再普细胞。）4小时后换液，然后每20小时左右换液，通常原代肝细胞难以增值，但是维持20天左右没问题。养原代小老鼠肝细胞肝实质由大量肝细胞为主组成,含间质量少,采用肝脏原位灌注消化法，从门静脉或其分支插管，用无钙缓冲液冲洗肝脏15min以清除血液和钙离子，然后用胶原酶液灌注15min，纤维组织网即被消化，其具体步骤如下:1、在3839度的水浴槽中预热Hepes缓冲液和胶原酶液，使其在肝内达到37度。2、给小鼠腹腔注射巴比妥钠（100uL/100g)，从股静脉注射肝素（1000IU）。3、打开腹腔，在门静脉的肝外5mm处松松地放置一个结扎线环，将血管套管插入到肝脏，结扎。4、快速切下肝下血管，灌注500ml无钙Hepes缓冲液，流速为30mL/min，数秒钟内肝脏即变白。5、灌注胶原酶300ml,15mL/min，持续20min，肝脏肿大。6、切下肝脏，用Hepes缓冲液清洗，切开肝纤维囊，收集消化液并混入100ml的1640培养液中，该悬液含大量肝细胞。7、用两层纱布过滤细胞悬液，室温下静置，使活细胞沉降20min，去除上层细胞碎屑和死细胞。8、低速离心法清洗细胞（50g,40sec)3次以去除胶原酶及非肝实质来源的细胞。9、将肝细胞收集在培养液中，其中加有0.2%BSA,10ug/mL牛胰岛素，常规co2孵箱内培养。注：无钙Hepes缓冲液，pH7.65；160.8mM Nacl; 3.15mM KCL; 0.7mM Na2HPO4.12H2O; 33mM Hepes, 最后用0.22um滤器过滤除菌，4度储存可保质2个月。1.两步法改良1、灌注液1含有EDTA的加有HEPAS的PBS，灌注液2是含有钙离子的50U胶原酶2，1mM HEPAS的PBS。24g留置针穿刺门静脉，接扎上腔静脉，剪开下腔静脉，50ml注射器灌注，灌注液1灌50ml，灌注液2灌30ml，时间都是5min两步灌流法的灌流液，ph值，氧气等因素，以及灌流时间很重要2.如果血细胞去的非常干净，可以不用percoll分离3，用低速离心（50g2min），死细胞在上层。4.台盼蓝检测后基本95%以上活性。我分离的通常在99%以上活性。成鼠肝细胞元代培养很难增值，但是维持1个月没问题。我最近在做小鼠原代肝细胞培养，虽然关于这方面的帖子很多，但是没有说我遇到的问题。1. 我也用胶原酶在体两步消化，在肝门静脉进针，有的时候针确实在血管中了但是各个肝叶的灌流反应不一样，有点类似花斑的变化，有的肝叶有部分淤血冲不出去。剪断下腔静脉后血冲出去了但感觉有残留。这是针进的有问题吗，进针之后也改过肝脏的摆放位置，但没有变化。2. 前灌注液和酶都灌完之后感觉肝脏比之前变大了，是因为肝脏里充盈液体还是水肿了呢，之前怀疑是流速快水肿了，减慢了流速，但是肝脏变大的现状没有太大的改变。是灌注液渗透压的问题吗，D-Hanks液配方（NaCl 8.0g，KCl 0.4g，KH2PO4 0.06g，NaHCO3 0.35g，Na2HPO4 0.048g，葡萄糖 1.0g）没加酚红，这会有影响吗。另外之前没加NaHCO3，因为有他过滤之后会影响PH，但是添加的各种盐加在一起也在0.85%0.9%的范围内啊，后来怀疑是渗透压的问题就加上了，但是灭菌（115度30min）之后感觉溶液不是和之前没加NaHCO3一样透明，有点淡淡的土黄色。反复配制几次灭菌都是一样，是这的问题吗3. 用0.035%的酶消化10分钟，但取下肝脏到撕开肝脏被摸还需要一段时间总时间是15min左右。得到的细胞不是很多，细胞碎片很多，但也有组织块，就是各个肝叶的消化状况不一样，感觉消化的不是很好，是时间短吗，但是如果消化时间太长的话细胞不会缺氧死掉吗。4. 再就是离心的问题，因为实验室没有四度的离心机，怕温度影响，离心的时候在离心管上套上有碎冰的冰袋，影响很大吗迫切的盼望各位高手给予指点您好，我分离肝脏的KUPFER细胞已经有两年了，积累了一点经验，你所遇到的问题都是我曾经遇到过的。首先，第一个问题，出现花斑肝，是由于空气栓塞，也就是说，你在灌流的时候，有气体从穿刺针进入到了肝脏，空气栓塞是灌流的大忌，会导致灌流不良，消化不彻底等情况存在。第二个问题：灌流后肝脏肯定会膨大，因为有液体潴留在里面。第三个问题：消化不好，有很多原因，比如：空气栓塞，血栓形成，胶原酶浓度，消化温度，还有就是胶原酶消化的时候需要Ca离子，你的胶原酶浓度是0.035%，以我的经验来看，已经够了，消化10分钟，时间也够了，出现个组织消化情况不一样，估计是形成空气或者血栓栓塞的可能大，要注意避免气泡进入肝脏，防止血栓形成的关键就是在插管前给动物肝素话。第四个问题：没有四度离心机是会有点影响，但不是很大，只要其他步骤都是在冰上进行。相关疾病：空气栓塞我是刚开始养细胞的新人，就碰上了肝窦内皮细胞这么有难度系数的。原代取了几次都不成功，主要就是灌注时消化不好，今天看了这贴才明白可能是空气栓塞，那怎么避免呢？我是先在血管上剪个小口然后直接用留置针软管插（直接用针头插不好，容易穿，而且文献里不是也说不用针头灌嘛），而且先开一下蠕动泵让液体从留置针头流出来一些然后再插管，这样也会进空气吗？怎样做能保证不进空气呢？我是直接用针头扎的，像打点滴一样，主要保证管里没有空气就可以了非常感谢！那就是不能在血管上剪个口再插了？那我再练练直接用针插吧！还有个问题，两步灌注法中第一步 Braet 方法用GBSS灌注，但我看到些资料说钙、镁离子会使细胞凝聚，消化液最好用无钙镁离子的，而且我看园里好多帖子也是用D-Hanks液灌的，到底该用哪个啊？第二步用含胶原酶的消化液灌是要加钙离子的吧？还有些问题。请问消化液是否要现配现用？一般配好的可保存多久？你们是用Percoll纯化的吗？Percoll液的保存方法和期限是多久啊？是否也是现配现用？前灌注液我是用D-Hanks液灌的，酶消化液加了钙离子，消化液我觉得现配现用或保存一段时间都可以，但是不要反复加热，多配的话得分装，时间长一点对消化力影响也不大。那第一步灌注就用GBSS先为下一步灌注创造一个有钙离子的环境是否更好些呢？第一步灌注是不加钙离子的，因为第一步的灌注就是要除去血液中和肝细胞间质中的钙离子，以使肝细胞易于分离，而钙离子又是保持胶原酶活性的必须物质，所以酶消化液要加钙离子请问你铺片是用什么呢？我用FN，浓度是22ug/ml，原液用灭菌水配的，用时再将分装的用pbs稀释。24孔板，每孔放0.5ml，在孵箱放一小时以上，然后将液体吸掉，pbs洗过后，加细胞悬液。可是效果不好，基本都不贴，细胞一直是卵圆形的，每天观察形态都没变化，后来怀疑细胞没贴壁可能已经死了。请问用什么可以让细胞贴壁好点啊？养肝细胞一般是用鼠尾胶原包被，在有一个就是你在接板子之前测定细胞活率了吗，也有可能是分离的肝细胞活率不高造成的，我养的是肝实质细胞，不确定鼠尾胶原对你的肝窦内皮细胞是否有用 培养基啊的DMEM我是将肝素2500U加到100ml前灌注液中，也有先单独打肝素的，本人近期在分离小鼠原代肝细胞，采用两步灌流法，具体步骤如下：1. 小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，酒精消毒皮肤，打开腹腔，暴露门静脉和下腔静脉2. 在门静脉远端剪开一小口，待无血液流出后插入留置针；下腔静脉剪开一小口，作为灌流液出口；生理盐水（约30ml）灌流至肝脏变成灰白色；继续用5ml 37预热生理盐水灌流(目的：预热肝脏)； 用0.03%胶原酶IV灌流 （灌流前结扎下腔静脉，待肝脏膨大后保持一份钟，打开下腔静脉使胶原酶流出， 如此反复4-5次，持续约10min）3. 剪下肝叶，肝脏剪成乳糜状，在0.03%胶原酶IV溶液中吹打，发现大量肝细胞呈单个存在，继续在37消化30min，每15min吹打一次4. 过滤，50% percoll分离液纯化， 接板存在问题：用上述方法分离小鼠原代肝细胞，之前两次分离的很好，一只小鼠可以接4-6块96孔板；但现在用同样的方法，发现分离后肝细胞全部死光了，在灌流、剪碎肝脏、吹打后 （37消化前）用台盼蓝染色，发现细胞全部蓝染., 而且细胞在percoll液中重悬、离心后发现细胞全部在上层，被DNA、结缔组织等黏黏的东西包裹在里面；把胶原酶、PBS、生理盐水全部换新，还是不能解决问题继续在37消化30min，每15min吹打一次会不会时间太长？不知道现在提的怎么样了呢？原代细胞分离还是不要消化那么久吧。前面的灌流等操作也是越快越好，保存细胞活力。我们原来做的时候会加一些DNase I，这样最后离心的时候细胞不会太黏探讨胶原酶经肝门静脉灌流分离肝细胞及培养的可行性。方法：取10只SD大鼠,按照改良Seglen原位两步胶原酶灌流法分离培养原代肝细胞。以SD大鼠作为肝细胞供体,采用型胶原酶经门静脉灌注,下腔静脉封闭保留胶原酶消化分离肝细胞,经200目筛过滤,滤液以200 r/min离心35 min,重复3次,纯化肝细胞。台盼蓝拒染实验检测分离细胞活性。将10只SD大鼠分离得到的肝细胞混合,稀释50倍后接种于包被有鼠尾胶原的培养皿或培养板中,倒置显微镜下观察分离肝细胞的形态特征,糖原染色法（PAS法）鉴定分离肝细胞,MTT法测定肝细胞在培养不同时期的增殖情况。结果：平均每只大鼠肝脏分离获得（1.80.14）108/mL肝细胞,细胞活率85%。肝细胞内因有大量的糖原颗粒,经PAS染色后被染成红色。MTT实验结果表明在培养的第八天肝细胞增殖达到峰值,培养的第九天细胞活力开始下降。结论：采用胶原酶经肝门静脉灌流分离肝细胞是一种简单、高效的获得肝细胞的方法。方法：将雄性Wistar大鼠于无菌条件下麻醉后固定,保持体温在37,对Seglen两步在体灌注分离原代肝细胞方法进行改进,采用先在体后离体的方法分离大鼠原代肝细胞,离心纯化后进行贴壁培养;（改良后的大鼠原代肝细胞分离方法应用于格列喹酮肝摄取方式的考察）直接机械剪切成1mm3的碎块,然后0.25%胰酶加0.02%EDTA消化40min,依次100目,200目,400目滤网过滤,然后50g,5min离心收集肝细胞,细胞活力在95%以上,但是损失较大.原代肝细胞的培养动物胚胎或幼龄动物器官、组织。将材料剪碎，并用胰蛋白酶处理（消化），处理形成单个细胞，将单个的细胞放入培养基中配成一定浓度的细胞悬浮液。悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，成为细胞贴壁。当贴壁细胞分裂生长到互相接触时，细胞就会停止分裂增殖，出现接触抑制。此时需要将出现接触抑制的细胞重新使用胰蛋白酶处理。再配成一定浓度的细胞悬浮液。另外，我们将培养10代以内的培养称为原代培养。10代以后的称为传代培养。培养1050代的细胞称为细胞株。当培养超过50代时，大多数的细胞已经衰老死亡，但仍有部分细胞发生