色谱讲稿2.doc

(三)、正相色谱与反相色谱: 正相 反相固定相极性 大 小流动相极性 小 大流出顺序 极性小的组分先流出 极性大的组分先流出三、 离子交换色谱:固定相: 离子交换树脂 分离对象:离子化合物流动相: 水溶液或缓冲液 分离机制:差速迁移(一) 树脂分类: 具有网状立体结构的高分子聚合物。 聚合骨架 阳离子交换反应：nRSOH + M （RSO）M + nH+ (树脂再生) (用NaOH滴定,由耗V求X%)(树脂可反复使用,用HCL浸泡,冲洗)阴离子交换反应：R-N(CH)OH + CL R-N(CH)CL OH (用酸标液滴定OH用可求X%)( 阴离子树脂的再生,用适当的碱液浸泡)(二) 、树脂的性能:1、 交联度:交换树脂中,交联剂(二乙烯苯)的含量为交联度,以重量百分比表示。交联度 网眼 交换 体积大的离子 大 小 慢 不易进入 小 大 快 大小离子均可进入阳离子交换树脂一般交联度8 % (常用)阴离子交换树脂一般交联度4 % 2、 交换容量:每克树脂能参加交换反应的活性基团数。单位: m mol/g ; m mol/ml3、 粒度:以溶涨态所能通过筛孔来表示。 1050目 交换水用; 100200目 分析用。三、 离子交换平衡常数:1、RAB RB A K= A+、B+分别表示树脂中A、B离子的浓度;A+、B+分别表示水液中A、B离子的浓度;若 K1,说明B+ 较牢地结合在树脂上 K 1,说明A+ 较牢地结合在树脂上所以K说明了树脂对A+、 B+两种离子选择性交换的能力,故也称之为选择性系数。K, B与树脂结合能力强, 洗脱慢, t。2、 选择性系数与分配系数的关系:K = = 即:分配系数不同是离子交换分离的先决条件。3、影响K的因素: (不讲)K随交联度而增大,还与被交联离子半径有关。(1) 强酸性聚苯乙烯阳离子交换树脂:同价离子,浓度相同时,随原子量增加与树脂亲和力增大。不同价态离子,价态高的离子亲和性大,即选择性大。(2)弱酸性阳离子交换树脂: 与(1)顺序有所不同P236 (自学) 2 薄层色谱法 TLC操作流程:铺板活化点样饱和展开显色定性,定量。一、 原理:将混合组分的试液,点在铺了吸附剂的玻璃板一端,在密闭容器中用适当的溶剂 (展开剂、流动相) 展开,各组分不断地被吸附,解吸附随展开剂前移,利用吸附剂对不同组分的吸附力 (吸附常数) 不同,产生差速迁移,而达到分离。特点: 快速、灵敏(几几十微克)、 高选择、显色方便。二、 参数:(一) 、定性参数: 比移值 R= R= a / c R = b / c讨论: R= 0 未移行 ( 被固定完全吸附, K ) R= 1 移至前沿 (组分不被固定相吸附, K 0 )一般: 0 R 1 R是薄层色谱的定性参数,在同一色谱条件下,同样结构的分子由相同的R值。(例: SMZ、TMP)某物质，当色谱条件一致时，R定值，定性用，但重现形差。有人建议用相对可比值定性。R= 参考斑可以是另加的物质,亦可以样品中另一组分为参考。R值的大小,主要取决于该组分在两相间的分配系数,因此:R= V:薄层板的死体积; V:板固定相体积; K:该条件的分配系数物质极性大, 吸附力F强; 反之,物质极性小, 吸附力弱。 K和R大小,取决与流动相极性。其色谱过程如吸附柱色谱,不再介绍。R最佳范围: 0.30.5 ,也可控制在0.20.8使用。(二) 、分离参数: 分离度R = X、X色斑中心到原点的距离。W、W两色斑的峰宽(扫描测定)。一般亦可用纵向直径。三。 固定相:1、 吸附柱色谱的固定相薄层色谱也可以使用,但相薄层色谱所用的硅胶、Al2O3粒度比柱色谱更细。硅胶40 mm (一般要求200目左右)常用硅胶GF: 吸附剂、硅胶、粘合剂、石膏,掺入荧光剂254 nm,呈黄绿色。符号: 硅胶G 硅胶+ 石膏 硅胶H 硅胶(未加任何物质) 硅胶HF 硅胶不含粘合剂+荧光物质 硅胶GF 硅胶+石膏+荧光物质荧光板用于本身不发光的物质,且不易显色的物质,或有紫外吸收的物质。2、 铺板:常用平滑的玻璃板,洗净待用。软板: 吸附剂直接铺涂。最大缺点,风吹即飞(已不用)。硬板: 吸附剂+粘合剂糊状铺板凉干活化常用吸附剂: CMC-Na 羧甲基纤维素钠。0. 250.75%的CMC-Na水溶液与吸附剂3：1调粘研磨活化: 凉干的板在110活化1小时,于干燥器中备用。P 242243铺板方法自看。四、 展开剂选择: (同柱)仅操作方法不同。分离强极性物质,选择强极性展开剂,同时也应考虑固定相的活性。物质极性 吸附力 流动相极性 防止大 强 大 太牢，R太小小 弱 小 R太大分离混合样品时,展开剂选择一般规则:(1) 先用单一的中等极性展开剂试一下。(2)改用二元展开剂,其比例要摸索。目的: 改变展开剂的极性。例: A、B两组分试样 A B展开剂 苯 R 0.45 0.42 分不开 改为 苯+乙醇 R 0.38 0.52 可分开能否说出 A、B哪一组分极性大？显然B的极性大。因为展开剂极性加大时,极性大的组分R(相似相溶)。一般做实验组分R控制在0.20.8之间。溶剂选择与配比还可用优化方法, P 244246(自学)五、 点样与展开:(一) 、点样点样量一般在一几十mg, j 23 mm。 点样量太大,斑易拖尾,影响分离效果。注: 有时用于薄层制备与分离提取时,条状点样。点样位置: 距底边1.52cm处, 铅笔画线、点点。(二) 、展开:先饱和1520分钟,再展开,防止边缘效应。 展开剂浸薄层板下端0.5cm,不能浸住起始线,层析缸应密闭。展开方式:为单向展开,亦可双向展开、多次展开等。六、 定性与定量:(一) 、定性: 找斑所在位(求R)对照。1、 显色: 本身有色的可日光下显色紫外灯下显色:主要用于荧光物质有明显荧光斑、有紫外吸收的物质。显色剂 荧光薄层板:用于有紫外吸收的物质。(硅胶掺入少量荧光物质),紫外灯下整板呈黄绿色荧光,被测物质吸收紫外光呈暗斑。2、 定性分析: 比较组分与对照品R值。对未知样品,要几个展开体系均有一致R值,才可认为同一物质。(二) 、定量:1、 目视比色:色斑大小、深浅 (误差大,1030%)2、 洗脱法:刮下,溶解,光度法测定。5 % (基本符合微量分析误差要求)。3、 薄层扫描: 误差 5 % (符合要求)。 3 薄层扫描法一、薄层扫描仪:1、 光路: P251图20-10双波长双光束扫描,光经过两个单色器得到l,l的光,由斩光器分别将光照在薄层板上，经放大后得到吸收度信号是l和l的两波长吸光度之差。2、 波长选择原则：选择方法与双波长法类似。参比波长: l, 化合物吸收光谱的基线部分(即无吸收或吸收最小的波长)测定波长:l, 通常选择化合物吸收峰波长。如此测定消除了背景的吸收干扰,得到了较好的曲线。例P 251二、 AC曲线:不符合Beer-Lambert定律, 符合Kubelka-mark (克曼方程)及峰面积与进样量呈曲线关系。透光率T= i / I ( I: 照射光强, I:光透过微分薄层上的入射光强)反射率R= j / I (j:为反射光强度)透射法中: A=Lg( T/T) 反射法中: R = Lg( R/R)T、R空板透光率和反射率。 T、R 斑点的透光率和反射率。三、 扫描条件的选择:(一) 、测光方式:1、 吸收光度法:(1) 、透射法: A=Lg( T / T) = Lg ( T/ T ) (用于透明板)(2) 、反射法: A = Lg ( R/ R ) (适用于不透明层析板,如硅胶板,Al2O3板。2、 荧光法: 利用物质本身能发出荧光的强弱或板上暗斑(荧光淬灭)进行定量。荧光强度F=j I a b c = K C (j I a b此处不讲)(j :效率,I:入射光,a : 系数,b:薄层 c:样品浓度)(二) 、扫描方法:直线扫描:光束以直线轨迹通过色斑色斑外形规则时用。锯齿形扫描:光束以锯齿形轨迹移动色斑外形不规则时用。四、 定量方法:1、 外标一点法: 标准曲线通过原点时,才能用之。m / m = A / A (A : 峰面积 ; m: 样品或标品的量)2、 外标二点法: 标准曲线不通过原点时,用之。用两种浓度的对照品液(或一种浓度、两种点样量)与样品液对比定量。m = a + b A 式中: b = a = mbA(截距) 4 纸色谱法一、 基本原理LL分配色谱载体:滤纸的纸纤维固定相:滤纸上吸附的水分(2026%水分中有6%的水分通过氢键与纤维素 上的羟基结合成为复合物)流动相: 与水不相混溶的有机溶剂。操作类似于薄层,但原理却不同。定性参数: R(一) R与K的关系:R = R大, K小,极性小的物质; R小, K大,极性大的物质。由式: K愈小,R愈大。各组分K不同,就有不同的R,从而得以分离。(二) R的影响因素:1、 物质的化学结构:极性大的物质,水中分配多, R小。极性小的物质,水中分配少, R大。例: P 256 葡萄糖 鼠李糖 洋地黄毒甙分子中OH数 5 4 3 亲脂性基团 0 CH CH, CH 分子极性 大 次 小 R 小 中 大2、 色谱条件的影响:(1) 展开剂的极性: 展开剂的极性,极性物质R, 亲脂性组分R。(2) 展开剂蒸气: 对R影响较大,所以应先让蒸气将层析缸饱和,以免造成流动相的比例改变。(3) 温度:二、 实验条件选择:1、 选纸: 质地均匀, 无折痕。 若R小,选中速或快速滤纸; 若粘度大,选质地松的滤纸。若组分多,选中速或慢速滤纸。一般常选中速滤纸。2、 点样: 一般几几十 mg , j 23 mm3、 展开: 先饱和, 再展开, 与薄层类似