茶叶审评与检验部分课件 (2).doc

茶叶审评与检验部分课件我国现行有关茶叶检验标准内容包括产品标准、检验方法标准和包装、贮运标识标准。其中又分国际标准，出口商品茶标准、国内商品茶标准。国内商品茶标准分为国家标准、行业标准、地方标准和企业标准四大类。国家标准和行业标准又有强制性标准和推荐性标准之分。 我国茶叶检验方法标准检验方式：委托检验：生产或经营单位自己取样，委托质量技术监督检验部门进行的检验。检验结果仅对委托样的质量负责仲裁检验：有争议时，国家法定质量监督检验机构进行的监督检验：茶叶质量监督机构抽样检验：市场销售等型式检验：“例行检验”，茶厂正常投产定型产品的例行检验。内容包括产品质量标准中所列的全部检验项目。每年进行12次。交货检验：贸易过程中进行的质量检验物理检验（略）茶叶化学检验茶叶化学检验系采用化学方法或仪器测定，对标准所要求的成分进行测定，以确定其产品是否符合质量要求和饮用需要的一种技术手段。分特定化学检验和一般化学检验。常用器皿与仪器l一 器皿：烧杯、玻棒、滤纸、蒸发皿、分液漏斗、布氏漏斗、三角瓶、索氏抽提器、微量进样器等。l二 仪器：水浴锅、旋转蒸发仪、冷冻干燥机、高效液相色谱仪（HPLC ，High Performance Liquid Chromatography)、气相色谱仪（ GC）、高效薄层色谱仪（HPTLC ）、超声波清洗仪、原子吸收分光光度仪等。色谱技术的基本应用1 色谱的基本概念色谱法也称色层法或层析法，其分离驱动力来源于样品中各组分在两相间的浓度差，即相间分配系数的差别。不同组分在两相间的连续相对移动（分配和传递）的结果，可实现一系列组分的分离和分析的目的。2 色谱的分类2.1 固液分配色谱柱色谱（column chromatography，CC）（重点）；液相色谱（HPLC）；薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）；纸色谱（paper chromatography，PC）；尺寸排阻色谱（size exclusion chromatography ，SEC）；亲和色谱（affinity chromatography ，AC）；超临界流体色谱（supercritical fluid chromatography ，SFC）；毛细管电色谱（capillary elec-chromatography ，CE）；灌注色谱（perfusion chromatography ，PC）;离子交换色谱法（ion exchange chromatography, IEC） l2.2 固气、液气分配色谱气相色谱（gas chromatography ，GC）l2.3 液液分配色谱高速逆流色谱（High-speed Counter-current Chromatography，HSCCC） 3 柱色谱l3.1 流动相（mobile phase） 水、有机溶剂（甲醇、乙醇、丙酮等）l3.2 固定相（stationary phase) 聚酰胺（俗称尼龙-6，化学名聚己内酰胺）、硅胶、氧化铝、活性炭、葡聚糖凝胶、碳酸钙。4.1 常用HPLC检测器4.1.1 紫外-可见吸收检测器(UVD，选择性检测器)4.1.2 示差折光检测器（RID，通用性检测器）4.1.3 荧光检测器（FD ，选择性检测器）4.1.4 蒸发光散射检测器（ELSD ，通用性检测4.1.5 电导检测器（ECD ，选择性检测器）4.1.1 紫外-可见吸收检测器(UVD，选择性检测器)紫外-可见吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的。分子中价电子经紫外或可见光照射时，电子从低能级跃迁到高能级，此时电子就吸收了相应波长的光，这样产生的吸收光谱叫紫外-可见吸收光谱。紫外-可见吸收检测器作用原理：待测组分对特定波长的紫外或可见光有选择性吸收,适合于紫外或可见光区有吸收的溶质的测定。检测器输出信号的大小即吸光度与待测组分的浓度之间服从朗伯-比尔定律：A=KCL。即当用一适当波长的单色光照射吸光物质的溶液时,其吸光度A与溶液的浓度C和透光液层厚度L的乘积成正比，K为摩尔吸收系数，它与入射光的波长、溶液的性质以及温度有关。UVD分类固定波长：应用最多的是UV-254nm（其次是UV-280nm)，采用低压汞灯为光源（辐射波长的90%以上为254nm的紫外光），单色性好，有紫外吸收的有机物，一般在254nm都有吸收，所以可以检测许多有机化合物，因此是既经济又实用的一种检测器。可变波长：其多采用氘灯或钨灯为光源（配有光栅作单色光），提供200800范围内连续可调的紫外、可见光，可按待测样品的吸收特征任意选择工作波长（一般选各组分的最大吸收波长），提高了仪器选择性，拓宽了工作波长范围。但由于分光后的单色光较弱，它的灵敏度比固定波长检测器低。二极管阵列检测器（photo-diode-array detector , PDAD ）：采用钨灯和氘灯组合光源，有一个光电二极管组成检测元件，可同时检测180600nm内的光信号。EGCG光谱扫描图TF-3-G紫外-可见光电二极阵列图谱（最大吸收波长为280nm，同时在380nm、470nm处也有吸收。 ）优点：灵敏度高，选择性好，对流量、温度不敏感，可用梯度洗脱；线性范围宽，能同时检测主要成分和痕量成分。缺点：只适用于检测能吸收紫外、可见光的物质，而且流动相的选择性受到限制，要求流动相在测定波长下无吸收。4.1.2 示差折光检测器（RID，refractive index detector）作用原理：连续的监测纯流动相和包含样品的流动相之间折射率的差值测定样品的浓度，只要纯流动相与待测组分的折射率不同，检测器就会给出检测信号，其响应信号的大小与样品含量呈正比。原则上凡是与流动相折射率不同的待测物质都可用此检测器来测定，流动相与待测组分的折射率相差越大，检测器的灵敏度就越高。优点：通用性好，只要折射率与流动相不同的物质都可以检测，不破坏样品，操作简便，线性范围宽。缺点：灵敏度低，不适宜痕量分析，折射率随温度而变化，不能用于梯度洗脱度。4.1.3 荧光检测器（fluorescence detector , FD）作用原理：具有特殊结构的化合物受紫外光激发后（吸收一定波长的紫外光，称为激发光，波长为ex），能发射出比吸收的紫外光波长较长的光，即荧光（成为发射光，波长为em），在一定条件下，荧光强度与能产生荧光的物质的浓度呈线性关系。优点：灵敏度高，比紫外吸收检测器高101000倍，特别适合于痕量分析；线性范围较宽，但比紫外窄；受外界条件影响小，可用于梯度洗脱（要求流动相的溶剂不发射荧光）。缺点：由于是选择性检测器，应用范围受到限制；样品浓度较高时，荧光强度与浓度不再呈线性关系；对影响荧光测量的一些干扰（如背景荧光、猝灭效应等）非常敏感。4.1.4 蒸发光散射检测器（ELSD，evaporative light scattering detector）工作原理：组分的微小颗粒在光束照射下引起的光散射强度的差异。色谱流出组分进入雾化室雾化，并在漂移管内被加热，流动相被蒸发，而溶质形成极细的颗粒，并在检测池内被光束照射产生与其质量成比例的信号。ELSD的响应值直接与被洗脱组分的质量有关，故可用于梯度洗脱。4.1.5 电导检测器（ECD，electrical conductivity detector）工作原理：用于检测阳离子或阴离子的选择性检测器，是根据组分在某些介质中电离后所产生的电导的变化而测定该组分的含量。ECD的主要工作部件是电导池，工作时需保持恒温以防电导率随温度而变化。4.2 色谱柱分类一硅胶基质填料：1.正相色谱正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica）以及其它具有极性官能团,如胺基团（NH2,APS）和氰基团（CN,CPS）的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其它极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组份的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如：正己烷（Hexane）、氯仿（Chloroform）、二氯甲烷（Methylene Chloride）等。2.反相色谱反相色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组份最先被冲洗出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。常用的反相填料有：C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。二. 聚合物填料聚合物填料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸酯等，其主要优点是在pH值为114均可使用。相对于硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常有效。现有的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。三其它无机填料其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途。如，石墨化碳正逐渐成为反相色谱柱填料。这种填料的分离不同于硅胶 基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性。该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强。石墨化碳可用于分离 某些几何异构体,又由于在HPLC流动相中不会被溶解, 这类柱可在任何pH与温度下使用。氧化铝也可用于HPLC,氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可在pH高达12的流动相中使用。但由于 氧化铝与碱性化合物作用也很强，应用范围受到一定的限制，所以未能广泛应用。新型氧化锆基质色谱填料也可用于HPLC,商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化 锆微球色谱柱，应用pH范围114，温度可达100。由于氧化锆填料是最近几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行中。4.3 高效液相色谱法的特点高压、高速、高效、高灵敏度、应用范围广、易回收分离组分4.4 色谱图基本概念4.5 定性、定量分析4.4.1 定性分析定性分析的任务是确定色谱图上各个峰代表什么物质。各个物质在一定的色谱条件下都有一个确定的保留时间，因此保留时间是定性分析的基础。但由于在基线保留时间峰面积同一色谱条件下，不同的物质也可能具有近似或相同的保留时间，所以单靠色谱本身定性较复杂的未知物较困难，这需要和其它仪器分析方法如质谱、光谱以及化学分析法结合起来进行定性分析。通常依据样品的来源和性质不同选用不同的定性方法，下面介绍几种常用的方法。基线保留时间峰面积4.5.1.1 用标准物质对照保留值法：在相同的色谱条件下，将待测物质与标准物质分别进样，若两者保留值相同，可能是同一种物质，此方法比较简单，但要操作条件稳定。加入已知物增加峰高法：如果样品复杂，流出色谱峰间距太近，或操作条件不易控制时，可在试样中加入已知物的纯物质（估计与试样中某组分为同一物质），在相同条件下进样，对比加已知物前后的色谱峰，若后色谱图的某个色谱峰增高了，则原样中可能含有该已知物的成分。 双柱（或多柱）法：不同组分在同一色谱柱上可能有相近或相同的保留值，有可能出现定性错误，为此把试样和标准物质的混合物分别在极性完全不同的两根（或多根）柱子上进行色谱分离，若标准物与未知物的保留值在两根柱上始终重合，可判断为同一组分。4.5.1.2 与其它方法结合起来定性与化学方法结合：若分析样品的组分比较复杂，可采用一些特殊的化学试剂或物理方法，除去带某些官能团的化合物，然后比较处理前后两个样品的色谱图，便可能对某些组分进行定性分析。还可把色谱柱后的流出物分别通入特殊的化学试剂中，利用颜色变化、是否有沉淀等现象对样品进行定性鉴定。与其它仪器联用：色谱对一些复杂样品、天然产物等样品的定性仍有困难，可采用近代发展起来的联用技术，即把色谱与质谱、光谱联用，既利用了色谱的分离特性，又发挥了质谱、或光谱的定性特长，分离和定性同时进行。4.5.2 定量分析利用在一定操作条件下，待测组分的质量与色谱峰的峰面积或峰高成正比。4.5.2.1 峰面积的测量法 峰高乘半峰宽法： 峰高乘平均峰宽法：4.5.2.3 定量计算法归一法：将所有出峰组分的含量之和按100%计算的定量法。内标法：是将准确称量的纯物质作为内标物，加入到准确称取的样品中，根据内标物的质量与样品的质量及相应的色谱峰面积求出某组分的含量。外标法：把待测组分的纯物质配成不同浓度的标准系列，在一定操作条件下分别向色谱柱中注入相同体积的标准样品，测得各峰的峰面积或峰高，绘制标准曲线，在完全相同条件下，注入相同体积的待测样品，根据所得的峰面积或峰高从曲线上查得含量。4.5.2.2 定量校正因子色谱定量分析是基于组分的量与峰面积成比例，但峰面积之比，不代表相应组分的含量之比，原因是同一检测器对不同物质具有不同的响应灵敏度（敏感度），即使两种物质含量相同，在检测器上得到的信号往往不相等，因此，在进行定量分析时，对峰面积必须加以校正，因而引入定量校正因子。 =m/A（表示单位峰面积所代表组分量）。5 气相色谱仪(Gas Chromatography)气相色谱的特点：分离效能高、选择性高、灵敏度高、分析速度快、应用范围广5.1 分离系统分离系统由色谱柱组成，它是色谱仪的核心部件，其作用是分离样品。色谱柱主要有两类：填充柱和毛细管柱。5.2 气相色谱仪常用检测器5.3l5.2.1 热导检测器(TCD，thermal conductivity detector）l5.2.2 氢火焰离子化检测器（FID，flame ionization detector）l5.2.3 电子捕获检测器（ECD，electron capture detector）l5.2.4 火焰光度检测器（FPD，flame photometric detector）l5.2.5 脉冲式火焰光度检测器 (PFPD,pulse flame photometric detector)5.2.1 热导检测器(TCD，thermal conductivity detector)工作原理：利用不同的物质具有不同的热导系数，通过检测流经平衡电桥中钨丝电流信号的变化来检测样品的信号。5.2.2 氢火焰离子化检测器（FID，flame ionization detector）工作原理：l当试剂中各种含炭有机物经喷嘴进入离子室，在燃烧气和助燃气形成的火焰中燃烧时发生离子化反应，产生与各组分相应的离子，并在发射极（负极）和收集极（正极）间的静电场的作用下形成离子流，各自向发射极和收集极做定参考池测量池记录仪双臂热导池电路原理图向移动。这种离子流产生的电信号强度与组分浓度或质量成正比。经检测放大，即可由记录仪记录到对应于色谱柱分离出的组分的色谱图。5.2.3 电子捕获检测器（ECD,electron capture detector）工作原理：l在检测器离子室内封闭置放有放射源，当纯载气通过时即会被射线所电离，产生次级电子和正离子。在电极间的电场作用下，电子向阳极做定向移动，形成恒定基流（没有组分信号时的本底电流）。当携有电负性样品组分进入ECD时，这些组分就可能捕获这些低能量的自由电子，形成稳定的负离子，负离子再与载气正离子复合成中性化合物，使电流降低而产生负信号-倒峰。倒峰的大小与被测组分的浓度成正比例关系。ECD是一种高选择性、高灵敏度的检测器，应用广泛，仅次于TCD和FID，它的选择性是指它只对具有电负性的物质如含卤素、硫、磷、氧、氮的物质有响应，而且电负性越强，检测器的灵敏度越高；高灵敏度表现在能检测出的 10-14g/mL 电负性物质，因此可测定痕量的电负性物质多卤、多硫化合物，甾族化合物，金属有机物等，已广泛用于农药残留检测、生态污染分析、生化、医学、法学、以及环境监测等领域中。其缺点是线性范围窄、重现性较差等。5.2