人类细胞质RNA的提取ppt课件.ppt

人类细胞质RNA提取RT PCR的原理 方法琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用 第六组 人类细胞质RNA提取 真核细胞质总RNA主要由rRNA 80 85 tRNA和核内小分子RNA 10 15 mRNA 1 5 组成 其中rRNA tRNA和mRNA位于细胞质中 分离提纯RNA的目的 分析不同发育时期基因的表达状况获得新基因研究基因的拼接分析相应的蛋白产物 RNA的不稳定性 由于核糖残基的2 和3 位置带有羟基 RNA易于被RNA酶切割水解RNA酶含量丰富 加热后仍能够正确折叠恢复活性 不易失活 所以需要RNA酶抑制剂来抑制RNA酶的活性 3 分离高质量RNA RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值 1 常用的RNA酶抑制剂焦碳酸二乙酯 DEPC 是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂 它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性 从而抑制酶的活性 异硫氰酸胍 目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂 它在裂解组织的同时也使RNA酶失活 它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来 又对RNA酶有强烈的变性作用 氧钒核糖核苷复合物 由氧化钒离子和核苷形成的复合物 它和RNA酶结合形成过渡态类物质 几乎能完全抑制RNA酶的活性 RNA酶的蛋白抑制剂 RNasin 从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白 RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂 可以和多种RNA酶结合 使其失活 其它 SDS 尿素 硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用 2 RNA提取的一般步骤 RNA提取的一般步骤是 破碎组织 分离RNA 沉淀RNA 洗涤RNA 融解RNA 保存RNA 破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行可以用盐酸胍 硫氰酸胍 NP 40 SDS 蛋白酶K等破碎组织加入 ME可以抑制RNA酶活性 分离RNA一半用酚 氯仿等有机溶剂 加入少量异戊醇 经过此步 离心 RNA一般分布于上层 与蛋白层分开 沉淀RNA一般用乙醇 3MNaAc pH 5 2 或异丙醇 洗涤RNA使用70 乙醇洗涤 有时 为避免RNA被洗掉 此步可以省掉 洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇 但是不能过于干燥 否则不易溶解 融解RNA一般使用TE 保存RNA应该尽量低温 为了防止痕量RNase的污染 从富含RNase的样品 如胰脏 肝脏 中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA 对于长期贮存也应该如此 由于RNA的种类来源很多 因而提取制备方法各异 本次介绍的是Trizol法制备RNA Trizol法提取RNA TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂 可以直接从细胞或组织中提取总RNA 其含有苯酚 异硫氰酸胍等物质 能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶 在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性 因此对纯化RNA及标准化RNA的生产十分有用 Trizol试剂主要成分是苯酚 苯酚的主要作用是裂解细胞 使细胞中的蛋白 核酸物质解聚得到释放 苯酚虽可有效地变性蛋白质 但不能完全抑制RNA酶活性 因此TRIzol中还加入了8 羟基喹啉 异硫氰酸胍 巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase RNA酶 Trizol试剂裂解细胞并释放出RNA 酸性条件使RNA与DNA分离 加入氯仿后离心 样品分成水样层和有机层 RNA存在于水样层中 收集上面的的水样层后 RNA可以通过异丙醇以沉淀的方式还原 在除去水样层后 乙醇能沉淀析出中间层的DNA 在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白 试剂 DEPC 焦碳酸二乙酯 氯仿 异丙醇 无水乙醇 0 05 0 1 DEPC H2O 75 乙醇 TE缓冲液 琼脂糖 配制 1 DEPC水 1ml 1000ml双蒸水 1 DEPC水 1000ml容量瓶中静置4小时 2 75 乙醇 无水乙醇 DEPC水 20 保存 DEPC水需先高压 实验用品 基本过程 一 抽提二 分相三 RNA沉淀四 RNA清洗 一 抽提 细胞抽提1 组织取材后用灭菌的锡箔纸包好保存于液氮 实验时 在液氮中将组织研磨成粉末 趁液氮未挥发将粉末转移到EP管 室温5000rpm离心去上清 每50 100mg组织 加入1mlTrizol 反复抽吸均匀 二 分相3 在装有裂解物的离心管中加入0 2ml的氯仿 为Trizol总体积的1 5 振荡混匀30秒 室温下静置5分钟 4 12000rpm离心15分钟4 C 分相为三层 上层 RNA 约为Trizol的60 中间 DNA 下层 蛋白质 酚 氯仿 5 小心吸取上清液 转移到另一EP管中 1ml裂解物产生的上清液体积约为0 4 0 6ml 有机相和中间层含有DNA和蛋白质 避免触及 三 RNA沉淀6 上清液加入约0 5ml的异丙醇 振荡30秒混匀 室温下静置10分钟 7 4 C 离心12000rpm10分钟 8 RNA沉淀将在离心底的侧面形成 小心吸弃上清液 注意避免吸弃RNA沉淀 四 RNA清洗9 离心管加入1ml预冷的75 乙醇 1mlTrizol至少用1ml乙醇清洗DNA 振荡混匀30秒 使沉淀振荡起来 室温离心12000rpm 1 2分钟 尽可能吸弃上清液 防止RNA沉淀丢失 重复以上清洗步骤一次 在75 乙醇中 RNA在4 至少可以保存1周 20 至少可以保存1年 10 室温选择流动性小 倒置离心管于滤纸上 干燥RNA 但不能完全干燥 5 10分钟 用DEPC水15 l溶解沉淀 55 60 孵育10 15分钟 11 测量OD值后 样品放置 70 保存 一个月 RT PCR RT PCR 逆转录PCR 或者称反转录PCR reversetranscription PCR RT PCR 是聚合酶链式反应 PCR 的一种广泛应用的变形 在RT PCR中 一条RNA链被逆转录成为互补DNA 再以此为模板通过PCR进行DNA扩增 应用RT PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术 可以检测很低拷贝数的RNA 广泛应用于遗传病的诊断 并且可以用于定量监测某种RNA的含量 oligo 多聚体 相当于mRNA引物AMVRT 禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶MMLVRT 莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶dNTPs 脱氧核苷酸RNase RNA水解酶PCRBuffer RT PCR缓冲液MgCl2 2价镁离子 基本过程由一条RNA单链转录为互补DNA cDNA 称作 逆转录 由依赖RNA的DNA聚合酶即逆转录酶来完成 随后 DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成 随每个循环倍增 即通常的PCR 原先的RNA模板被RNA酶H降解 留下互补DNA RT PCR的关键步骤是在RNA的反转录 要求RNA模版为完整的且不含DNA 蛋白质等杂质 常用的反转录酶有两种 即鸟类成髓细胞性白细胞病毒 avianmyeloblastosisvirus AMV 反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒 moloneymurineleukemiavirus MMLV 反转录酶 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳主要是应用琼脂糖凝胶作为支持物的电泳法 借助琼脂糖凝胶的分子筛作用 核酸片段因其分子量或者分子形状的不同 电泳速度有差异而分离 这种技术是基因操作中常用的一种方法 与其他支持物电泳最主要区别是 它兼有 分子筛 和 电泳 的双重作用 PCR产物在琼脂糖凝胶上的电泳检测在基因组DNA的提取中 用蒸馏水溶解提取出