第五章 酶催化反应的介质.doc

第五章 非水酶学非水相酶催化的优点： 1、增强难溶于水的反应物的溶解度。 2、在有机介质中改变反应平衡。 3、酶制剂易于回收再利用。 4、在有机溶剂中可增强酶的稳定性。 5、在有机溶剂中可改变酶的选择性。 6、不会或很少发生微生物污染。第一节 酶催化反应的介质水是酶促反应最常用的反应介质。但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多有机化合物(底物)在水介质中难溶或不溶。由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应的发生。是否存在非水介质能保证酶催化？1984年，克利巴诺夫等人在有机介质中进行了酶催化反应的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应。酶非水相催化的几种类型有机介质中的酶催化 有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。气相介质中的酶催化 酶在气相介质中进行的催化反应。适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。由于气体介质的密度低，扩散容易，因此酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点。超临界介质中的酶催化 酶在超临界流体中进行的催化反应。超临界流体是指温度和压力超过某物质超临界点的流体。 离子液介质中的酶催化 酶在离子液中进行的催化作用。离子液（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。 第二节 有机介质酶反应体系一、有机介质反应体系 非极性有机溶剂酶悬浮体系(微水介质体系) 用非极性有机溶剂取代所有的大量水，使固体酶悬浮在有机相中。但仍然含有必需的结合水以保持酶的催化活性 (含水量一般小于2%)。 酶的状态可以是结晶态、冻干状态、沉淀状态，或者吸附在固体载体表面上。与水互溶的有机溶剂水单相体系有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。酶、底物和产物都能溶解在这种体系中。 非极性有机溶剂水两相/多相体系由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂(高脂溶性)相所组成的两相体系。正胶束体系酶在胶束外面的水溶液中，疏水性的底物或产物在胶束内部，反应在胶束的两相界面进行。 反胶束体系酶在反胶束内部的水溶液中，疏水性的底物或产物在反胶束外部，反应在胶束的两相界面进行。 不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含有机溶剂和一定量的水。它们都对催化反应有显著的影响。 表面活性剂表面活性剂：表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子。在有机相酶反应中用得最多的是阴离子表面活性剂： AOT，其化学名为丁二酸-2-乙基酯磺酸钠。 临胶束浓度临胶束浓度：是胶束形成时所需表面活性剂的最低浓度，用CMC来表示。正向微团：极性头部向外，与水结合；疏水尾部向内，形成一个非极性的核心。反向微团：疏水尾部向外，与非极性的有机溶剂接触；极性头部向内，形成一个极性核。反胶束体系的制备n 将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度（CMC），便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体则为反胶束。二、有机相酶反应应具备的条件 1 保证必需水含量2 选择合适的酶及酶形式3 选择合适的溶剂及反应体系4 底物及其浓度5. 温度6. pH和离子强度水是保证酶催化反应的必需条件，活性构象是水分子直接或间接由氢键等非共价键相互作用来维持。 因此与酶分子紧密结合的一单层水分子对催化作用非常重要。而其他的水则相对不那么重要(即由有机介质替代的那部分水不那么重要了）。1、必需水紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需的最少量水。 必需水：是维系酶构象稳定和酶催化活性所必需的那部分最少量的水分子，有时也叫结合水，或者束缚水。只要那部分必需水不丢失，其他的大部分水可以由有机溶剂代替。 所以，有机介质中的酶促反应在微观上看是水的酶反应，但是在宏观上看是有机介质中的酶反应。如有的酶反应即使水只占0.015%， 酶仍然有活性，可以进行酶反应，而且反应速度非常快。 干燥的酶水合过程：（1） 与酶分子表面带电基团结合达到0-0.07g/g（水/酶）（2） 与表面的极性基团结合(0.07-0.25g/g)（3） 凝聚到表面相互作用较弱的部位（0.250.38g/g）（4） 酶分子表面完全水化，被一层水分子覆盖。影响酶反应体系中需水量的因素A不同酶需水量不同B同一种酶在不同有机溶剂中需水量不同，溶剂疏水性越强，需水量越少表征必需水作用的参数-热力学水活度 水活度（activity of water, w）：指体系中水的逸度和纯水的逸度之比，通常可以用体系中水的蒸汽压与相同条件下纯水的蒸汽压之比来表示。 w=p/p0 式中p为在一定条件下体系中水的蒸汽压，p0为同等条件下纯水的蒸汽压。 水活度的大小直接反映出酶分子结合水的多少，而与体系中的含水量及所用溶剂无关，与所用溶剂的极性大小也没有关系。水活度大小可用测定反应物平衡的液面上气体的相对湿度得到。2. 酶的选择n 酶种类的选择：脂肪酶、蛋白酶、次黄嘌呤氧化酶、过氧化氢酶，过氧化物酶等。除与酶有关，还与酶-底物、产物-溶剂间关系有关。（1）酶粉：例如：有人研究a-胰凝乳蛋白酶在酒精中转酯反应，发现催化活性随反应体系中酶量的减少而显著增加。（2） 化学修饰酶：例如：SOD酶经糖脂修饰后变成脂溶性，它对温度、pH、蛋白酶水解的稳定性均高于天然SOD。（3） 固定化酶：把酶吸附在不溶性载体上（如硅胶、硅藻土、玻璃珠等）制成固定化酶，其对抗有机介质变性的能力、反应速度、热稳定性等都可提高。有机相中固定化后载体对酶的影响 A. 载体能通过分配效应剧烈地改变酶微环境中底物和产物的局部浓度。B. 载体影响酶分子上的结合水 通过选择合适的载体可使体系中的水进行有利分配C. 通过载体与酶之间形成的多点结合作用，可稳定酶的催化活性构象。例：-胰凝乳蛋白酶与聚丙烯酰胺凝胶共价结合后，在乙醇中的稳定性明显提高，并且对有机溶剂的抗性随酶与载体间共价键数量的增加而增强。D. 酶动力学影响一个酶同时催化的两个反应的相对速度。例 在低水活度下把胰凝乳蛋白酶固定在聚酰胺载体上，水解反应被抑制却有利于醇解反应。3. 溶剂及反应体系的选择n 水溶性有机溶剂：甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、甘油、丙酮、乙晴等n 水不溶性的有：石油醚、己烷、庚烷、苯、甲苯、四氯化碳、氯仿、乙醚等酶促反应有机介质体系 （1）单相共溶剂体系（水/水溶性有机熔剂） （2）两相体系（水/水不溶性有机溶剂） （3）低水有机溶剂体系（有机溶剂体系） （4）反胶束体系有机溶剂的极性： 有机溶剂的极性的强弱用极性系数lgP表示。P是指溶剂在正辛醇与水两相中的分配系数。极性系数越大，表明其极性越小，极性系数越小，则极性越强。极性过强（ lgP 2 ）的溶剂，会降低酶反应速度，一般情况下不选用；极性过弱（ lgP 5 ）的溶剂，催化反应速度也不高；通常选用2lgP 5的溶剂作为催化反应介质。4. 底物的选择和浓度控制 根据酶在所使用的有机介质中的专一性选择适宜的底物。 底物浓度较低时速度随底物浓度升高而增大；底物达到一定浓度后随底物浓度升高，速度增幅减少，趋于平衡，接近最大反应速度。5. 温度控制 在微水有机介质中，由于水含量低，酶的热稳定性增强，所以其最适温度高于在水溶液中催化的最适温度。6. pH选择和离子强度的影响（1） pH选择： 在有机溶剂的环境中，不会发生质子化及脱质子化的现象。酶在水相的pH值可在有机相中保持，同一种酶不同来源，对pH值敏感程度大不相同。（2）离子强度影响随着冻干时用的缓冲溶液的离子强度增大，酶活会增大。三、有机溶剂对对有机介质中酶的影响有机溶剂对酶结构与功能的影响有机溶剂对酶分子表面结构的影响有机溶剂对酶活性中心结合位点的影响有机溶剂对酶活性的影响有机溶剂对产物和底物分配的影响选择有机溶剂必须考虑因素： (1) 有机溶剂与反应的匹配性（即相容性）（包括反应产物与溶剂的匹配性，极性产物倾向于保留在酶附近，可能引起产物抑制或不必要的副反应发生。(2) 溶剂必须对于该主反应是惰性的制剂。 例：酯基转移反应涉及到醇对于酯的亲核攻击而产生另一种酯，如果溶剂也是酯，就会生成以溶剂为基础的酯，如果溶剂是醇，也会得到类似结果。(3) 必须考虑的其他因素 溶剂的密度、黏度、表面张力、毒性、废物处理和成本等（溶剂因底物而宜）四、水对有机介质中酶的影响水对酶分子空间构像的影响水对酶催化反应速度的影响水活度必需水含量五、有机相酶反应的优点1 有利于疏水性底物的反应2 可提高酶的热稳定性3 能催化在水中不能进行的反应4 可改变反应平衡移动方向5 可控制底物专一性6 可防止由水引起的副反应7 可扩大反应pH值的适应性8 酶易于实现固定化9 酶和产物易于回收10. 消除底物、产物的抑制作用。11. 可避免微生物污染第三节 酶在有机介质中的催化特性酶在有机介质中起催化作用时，由于有机溶剂的极性与水有很大差别，对酶的表面结构、活性中心的结合部位和底物性质都会产生一定的影响，从而显示出与水相介质中不同的催化特性。n 底物特异性n 立体选择性n 区域选择性n 键选择性n 热稳定性n pH值特性专一性n 某一些有机介质可能使某些酶的专一性发生变化，这是酶活性中心构象刚性增强的结果。n 有些在水中不能实现的反应途径，在有机介质中却成为主导反应。稳定性（1）热稳定性提高 （2）储存稳定性提高 低水有机溶剂体系中，酶的稳定性与含水量密切相关；一般在低于临界含水量范围内酶很稳定；含水量超出临界含水量后酶稳定性随含水量的增加而急剧下降。pH值特性 酶所处的pH环境与酶在冻干或吸附到载体上之