青蒿素的药用价值研究.doc

青蒿素的药用价值研究井冈山大学 11级药学本（1）班 胡文建 111116027摘要：青蒿属菊科植物，青蒿素是青蒿叶中分离的抗疟有效成份，具有过氧基团的倍半萜内酯，是我国首先发现的新构型的抗疟药。体内代谢活性产物为双氢青蒿素，抗疟活性高，毒性小。具有清热解毒、抗肿瘤、抗菌、抗疟、增强免疫等作用。在医疗卫生领域拥有广阔的发展前景，下文主要对青蒿素的药用价值和提取进行综述。Abstract: Sweet wormwood the compositae plants, artemisinin is sweet wormwood leaf the separation of antimalarial effective components, with the oxygen base half terpene inner fat, it is Chinas first discoveries of new configuration antimalarials . The body metabolism active products are double hydrogen artemisinin, antimalarial high activity and low toxicity. Double hydrogen artemisinin has the clearing away heat and toxic material, antitumor and antibacterial, antimalarial; enhance the immune function, etc. It has broad prospects for development in medical and health. Blow mainly to artemisinin medicinal value and extraction were reviewed in this article.关键词：青蒿素、药用价值、青蒿素提取、应用 Keywords: Artemisinin medicinal value artemisinins extraction application正文：青蒿素（Artemisinin）是我国科学工作者于1972年率先从分类学上的黄花蒿中分离并鉴定出来的抗疟疾有效单体，为一种高效抗疟新药。青蒿素受热容易分解，它具有高效、速效、低毒的特点，优于氯喹和现有的其他抗疟性药物，已成为世界卫生组织推荐的治疗疟疾的理想药物。1.青蒿素的提取1.1传统提取方法 冷浸提取、回流提取、索氏提取、温浸提取等。主要是利用青蒿素的溶解性而提取。研究表明，石油醚是较适宜的提取物质。然而传统的有机试剂提取青蒿素虽然工艺路线纯熟，但需要经过多次萃取浓缩，因此操作困难、精制困难。1.2超临界CO2萃取 超临界萃取是一种新兴的萃取分离技术。超临界流体具有较高的扩散传质速率和溶解性能（能通过改变CO2密度和温度、压力等操作参数可改变青蒿素的溶解性），在有效成分含量较低的天然药物提取分离方面有独特的优势。该法将CO2高压液化作为萃取剂，工艺路线简单，周期短，常温可进行。CO2价格低，无毒，不燃，可循环使用，生产无环境污染。萃取物中杂质含量低，提取 简单，收率高，但一次性设备投资太大。1.3化学合成 目前世界上青蒿素类药物的生产主要是从青蒿植物中提取，但青蒿植物中青蒿素的含量较低，难以满足市场需求。1983年许杏虎等人完成了从青蒿酸到青蒿素的半合成。1983年Schmil等以异薄勒酸为原料经13步反应得到青蒿素。青蒿素虽已能化学合成。但成本较高，毒性较大、产量低难以进行商业化生产1.4微波萃取技术 微波萃取技术具有萃取时间短、溶剂用量少、提取率高、溶剂回收率高等优点。在青蒿素的提取中，随着微波辐射时间的增加，青蒿素的提取率也随之增大，但最终趋于恒定。研究表明，用微波处理干粉，可明显提高青蒿素的提取率1.5生物合成 愈伤组织诱导丛生芽。青蒿的组织培养一般是先诱导出愈伤组织，然后由愈伤组织诱导出丛生芽。众多学者对组织培养中的基因型、基本培养基、培养条件、激素及其他添加物进行研究，发现基因型对诱导率的影响最大，其次是激素和其他添加物2.青蒿素的药用价值2.1抗疟作用 青蒿素类衍生物在Fe()或者其他还原性物质作用下产生一些活性中间体(包括自由基、Fe()=O、亲电中间体和活性氧等) 1.这些中间体通过过氧化膜脂质、干扰线粒体的功能、烷基化、与疟原虫的蛋白质作用等途径杀死疟原虫.2.1 过氧化疟原虫细胞膜显微镜观察14C标记的青蒿素和3H-双氢青蒿素对疟原虫超微结构的影响,作用4h后核糖体消失,疟原虫的食物泡遭到破坏2,这是典型的自由基过氧化反应疟原虫体内的血红素可以催化青蒿素产生大量的自由基.自由基过氧化细胞膜上的不饱和脂肪酸,这不仅能够促进疟原虫体内红细胞的衰老和溶解,而且还可导致膜组分和结构的改变.有实验证实在血红素诱导下青蒿素加重了疟原虫膜的.因而,青蒿素类衍生物能引起疟原虫细胞膜损伤,导致其食物泡破裂,从而使疟原虫开始自消化直至死亡.2.2 干扰线粒体功能青蒿素衍生物产生抗疟作用时,除了影响疟原虫体内细胞膜外,还会作用于其线粒体.青蒿素治疗猴疟215 h后会使寄生虫的线粒体膨胀,但不影响未感染的宿主细胞.二氢乳清酸脱氢(DHOD)是线粒体电子转移链反应的主要电子源,而青蒿素能够抑制疟原虫DHOD的活性.根据这些研究初步推断疟原虫线粒体可能是青蒿素类衍生物潜在的作用靶位3.最新研究揭示青蒿素通过低疟原虫线粒体的膜电位使其线粒体的功能失常.研究人员认为青蒿素与疟原虫线粒体作用的步骤是:首先电子转移链激活青蒿素的活性,产生活性氧.反过来,产物活性氧又破坏了线粒体的功能.当线粒体的活动被阻止后,影响嘧啶和ATP的合成,使疟原虫代谢紊乱而死亡.2.3 烷基化作用烷基化作用是目前大多数学者最支持、研究也最深入的青蒿素抗疟机制.2.3.1 烷基化血红素 血红素(heme)不仅是青蒿素类衍生物的还原裂解催化剂,而且是烷基化的要靶点.1HNMR检测到金属卟啉Mn()TPP与青蒿素体外反应生成的络合物.患疟疾的老鼠服用青蒿素后,其脾内含有药物与heme的复合物,而健康的老鼠用药后却观察不到两者的复合物.该项研究说明在生物体内青蒿素同样可以烷基化heme.血红素与青蒿素形成络合物是通过碳自由基中间体作用的,这支持了血红素介导的两步抗疟作用学说.第一步,血红素的亚铁离子诱导青蒿素生成碳自由基中间体;第二步,碳自由基烷基化heme.上述实验只能说明青蒿素类衍生物具有烷基化heme的性质,下面的研究工作则表明烷基化能力决定了这类化合物的生物活性4.研究合成的1, 2, 4-三烷衍生物与Mn()-TPP的反应,发现有活性的合物能形成卟啉环复合物,没有活性的化合物则不反应;尽管一些青蒿素衍生物与Mn()-TPP反应时可以产生碳自由基,但不能与之发生烷基化,体外活性实验证实这些化合物无抗疟作用.由此可见,烷基化heme是该类化合物具有抗疟作用的一个重要因子.用光谱测定一系列9位C取代青蒿素类似物与heme之间的亲和力,通过分析发现其与抗疟活性之间具有明显的相关性,亲和力的大小能较好地反映抗疟活性的强弱.科学家们基于烷基化机理设计的新化合物Trioxaquines是目前最有望成为抗疟药的青蒿素衍生物.可见,烷基化机理对于设计新的抗疟药物具有重要的指导意义.2,2抗血吸虫青蒿素的衍生物青蒿琥酯和蒿甲醚等已用于预防和治疗血吸虫感染。肖树华等在小鼠感染第7天开始采用蒿甲醚进行治疗,剂量为300 mg/kg,连续用药4次,减雌率可达到90%。为研究蒿甲醚预防血吸虫感染的作用,肖树华等对小鼠、兔和犬按一定的,总减雌率和减虫率可达到97%。并且蒿甲醚在兔和小鼠预防实验中的作用效果不同,;而在小鼠实验中,蒿甲醚的剂量-效应关系并不明显。尤纪青等报道,蒿甲醚与吡喹酮伍用并不能增强对不同发育期日血吸虫的作用效果。但Utzinger等报道,低剂量蒿甲醚和吡喹酮联合用药比单独使用吡喹酮治疗曼氏血吸虫病作用效果更安全和有效。推测蒿甲醚和吡喹酮采用不同的联合用药方法和用药时段及对不同种的血吸虫作用效果存在差异。实验动物于感染日本血吸虫尾蚴后第7天开始喂服青蒿琥酯,剂量分别为小鼠300 mg/kg,兔20 mg/kg及犬30 mg/kg,每周1次,服用46次,对小鼠、兔和犬的减虫率达90. 00% 99. 53%;小鼠实验证明,在感染尾蚴后69 d给药减虫率显著高于其他给药时间,表明体内69 d龄童虫对青蒿琥酯最为敏感,据此认为预防服药的最佳时间为感染后的78 d5。青蒿琥酯预防小鼠曼氏吸虫病的最佳剂量为300 mg/kg, 14、21 d童虫对药物最为敏感,减虫率分别为84%和93%。2.3抗肿瘤作用2.3.1 自由基的产生及氧化应激关于青蒿素类药物的抗癌效应的始发机制，有些研究者认为与青蒿素类药物的抗疟机制和肿瘤细胞代谢的特点有关。青蒿素类药物的抗疟作用主要因其具有独特的过氧桥结构，可以被铁裂解产生大量自由基，进而形成一些亲电子化合物，攻击细胞膜或细胞内其他膜性结构。除了氧化损伤蛋白质分子，还可以烷化DNA，由此引发虫体产生一系列生化反应，最终导致虫体死亡。阿霉素、维生素K3、维生素B26等自由基引发剂与青蒿素药物具有协同抗疟作用，而自由基清除剂过氧化氢酶、生育酚、二硫苏糖醇及谷胱甘肽等则能降低抗疟作用8。抗疟机制可以作为青蒿素抗肿瘤机制的借鉴。Singh等提出癌细胞的核酸代谢旺盛，需要大量铁质，大多数肿瘤细胞表面高密度的转铁蛋白受体，正常细胞转铁蛋白受体较少。含有内过氧桥的青蒿素类药物则通过二价铁离子，促进过氧基团分解产生自由基，发挥破坏作用，从而使肿瘤细胞较正常细胞形成更多的自由基，起到选择性杀伤作用。氧化应激是活性氧氧化损伤力与抗氧化系统抗氧化力之差，是活性氧介质活性过强的一种状态，在青蒿琥酯杀伤肿瘤细胞机制中起到一定作用。肿瘤细胞内自由基产生过多，导致氧化与抗氧化酶系统失衡，从而引起反应性氧族活性增强，氧化应激程度增加。在关于抗氧化基因的表达对青蒿素类药物活性影响的研究中发现，硫氧还蛋白还原酶的表达与青蒿琥酯的半抑制浓度（IC50）呈明显正相关，而过氧化氢酶的表达与 IC50呈负相关，并且使耐受过氧化氢或者转染了硫氧还蛋白、过氧化氢酶等的小鼠胸腺瘤细胞对青蒿琥酯产生抵抗。2.3.2 延迟细胞周期，诱导细胞凋亡实验采用一组有某种特定基因突变的同基因酵母菌，发现有丝分裂调控基因 BUB3 缺陷者对青蒿琥酯的敏感性增加，而有增殖调控基因 CLN2 缺陷的酵母菌对青蒿琥酯的抗性增加。实验结果提示青蒿琥酯抑制细胞生长的作用与细胞周期调控有关。Li等 发现含氰基和芳香基的青蒿素衍生物对小鼠白血病细胞 P388和人肺腺癌细胞 A549 具有明显的抗增殖效应，并且可以使 P388细胞阻滞在 G1期并诱导其凋亡。目前已发现了与细胞凋亡相关的 30 多种基因，主要包括 Fas 家族、bcl-2 家族和 p53 等。由于有些基因的表达具有细胞类型特异性，所以不同类型的细胞凋亡相关基因也不完全相同。杨小平等将肝癌细胞 BEL-7402 经青蒿酯钠处理后，用流式细胞细胞周期，发现在 DNA 直方图中青蒿酯钠加药组肝癌细胞G1细胞峰减少，G1峰左侧出现凋亡峰。在荧光显微镜下可观察到经青蒿酯钠处理的细胞出现凋亡，细胞核和细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光，并可见典型的新月形改变、固缩或片段化核。采用 Western 印迹法检测 p53、p21 和 bc1-2。结果显示，在凋亡细胞中 p53、p21 表达与对照组相比无明显变化，而 Bcl-2 蛋白表达水平随药物作用时间的延长呈降低的趋势，表明青蒿酯钠诱导肝癌细胞凋亡的分子机制是 p53 非依赖性的，与凋亡调节基因 bcl-2下调有关。李哲等7在青蒿琥酯诱导 HL-60 早幼粒白血病细胞株凋亡实验中发现，细胞浆内 Caspase 3的活性呈浓度依赖性增强，显著高于对照组。通过RT-PCR、Western 印迹法，观察到 survivin mRNA 和蛋白的表达均降低，提示青蒿琥酯诱导肿瘤细胞凋亡效应的机制，除了通过在细胞内产生自由基的继发损伤外，还与抑制家族成员 survivin 基因的表达有关。推测青蒿琥酯通过抑制 survivin 蛋白表达，间接增强肿瘤细胞内 Caspases 蛋白酶家族成员的活性，使肿瘤细胞更容易发生凋亡。青蒿素及其衍生物的抗瘤作用机制与细胞周期调控和凋亡有关，其具体作用靶点和机制还有待进一步研究。2.3.3 抗肿瘤血管生成肿瘤的生长与转移依赖血管生成，从而建立丰富的血液循环，以供应肿瘤组织异常旺盛的生化代谢以及瘤细胞的增殖与转移。最近研究表明，青蒿琥酯和二氢青蒿素具有抗肿瘤血管生成作用。Chen等用人脐静脉内皮细胞（HUVEC） 的生长、迁移及小管形成实验研究青蒿琥酯的体外抗血管生成作用，结果发现该药对这三个环节均有较强的作用。在裸鼠人卵巢癌移植瘤模型中，通过免疫组化发现，青蒿琥酯下调肿瘤细胞的VEGF表达及肿瘤细胞和血管内皮细胞KDR/flk-1受体的表达。研究表明青蒿琥酯对人脐静脉血管内皮细胞的增殖抑制强于对肿瘤细胞的抑制，并且在诱导肿瘤细胞凋亡之前已经出现抗血管生成作用。DellEva发现青蒿琥酯不仅诱导卡波济氏肉瘤细胞凋亡，而且抑制肿瘤血管的生成。青蒿素衍生物对肿瘤血管生成的抑制作用，主要与其抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和分化有关，另外与血管内皮生长因子VEGF及其受体KDR/flk-1的表达抑制亦有关。2.4抗心律失常作用 青蒿素临床上主要用于抗疟原虫疾病。我室用膜片钳研究发现,青蒿素具有浓度依赖性抑制家兔心室肌细胞IK1。用基因钳研究证明,给予非洲蛙卵母细胞注射Iir2.1cRNA后,青蒿素对Kir2.1/IK1有明显抑制作用。IK1及Kir2.1和心肌动作电位复极末期有关,和心律失常的发生发展有密切联系,是抗心律失常药物作用的重要靶点。但是青蒿素对乌头碱和哇巴因诱发大鼠及豚鼠心律失常作用如何尚无报道。本试验采用乌头碱诱发大鼠心律失常模型和哇巴因诱发豚鼠心律失常模型研究了青蒿素对动物实验性心律失常的作用,为临床用药提供理论依据2.6对免疫系统的作用1 系统性红斑狼疮系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种复杂的自身免疫病，以抗核抗体为代表的自身抗体的产生、免疫复合物沉积及多系统损为特征，SLE 的发病机制涉及了固有免疫参与的免疫耐受的丧失、淋巴细胞的异常活化以及免疫效应阶段的组织病理损伤等免疫应答的多个层面8。近年来用青蒿素类药物治疗SLE有较多研究。2.6.1对免疫细胞的影响CD4和CD8分别是辅助性T细胞和细胞毒性T细胞的表面标志。SLE患者中T细胞总数通常是减少的，而且存在T细胞功能障碍，以CD4+T细胞活性增加和CD8+T细胞活性减弱为特征。在NZB/NZW F1狼疮小鼠及SLE患者可发现CD8+T细胞数量减少、功能障碍。CD54为细胞间黏附因子-1（ICAM-1）表面标志，T细胞的识别和活化、细胞毒T细胞对靶细胞的杀伤及T、B淋巴细胞间的相互作用等均有ICAM-1参与。采用直接免疫荧光法检测，发现双氢青蒿素可以增加狼疮小鼠T淋巴细胞（尤其是CD8+T细胞）的数量，同时抑制B淋巴细胞增殖。用流式细胞仪检测亦发现高剂量的青蒿琥酯片（1.68mg/只）可升高狼疮小鼠外周血CD4、CD8同时抑制CD54的表达。因此推断青蒿琥酯可调节狼疮小鼠的细胞免疫功能，改善T细胞功能、抑制B细胞的过度活化及过度免疫反应，双向调节免疫反应。自然杀伤性T细胞（NK细胞）是重要的免疫活性细胞，其主要功能是参与免疫调节，可作用于T、B细胞对免疫系统起广泛的调节作用。有报道提示青蒿素对NK细胞具有较强的抑制作用9，同时还能提高巨噬细胞、中性粒细胞的吞噬活性。2.6.2 对自身抗体的影响SLE患者的血清中含有多种自身抗体，抗ds-DNA抗体是SLE的特异性标志，与狼疮性肾炎的活动相关。双氢青蒿素灌胃能显著抑制狼疮小鼠血清中抗ds-DNA抗体以及TNF-水平，同时可明显改善其肾脏病理改变，抑制肾组织中NF-B的活化及其蛋白p65的水平，从而抑制多种免疫球蛋白及补体在肾脏沉积，减轻小鼠的肾脏损害。青蒿琥酯亦能降低MRL/lpr小鼠抗ds-DNA抗体和抗核抗体、减少蛋白尿排泄、降低血肌酐、增加小鼠体重、延长生存期、抑制脾脏B细胞刺激因子（BAFF）mRNA的表达，显示对狼疮的治疗作用。2.6.3 对细胞因子的作用IL-6曾称为干扰素-2、B细胞刺激因子-2等，其作用主要是增加T细胞IL-2生成和B细胞Ig生成，是B细胞终末分化并分泌抗体的必需因子，IL-6高达则导致B细胞活性增强并产生大量的自身抗体。因此，抑制IL-6的分泌能够调节体液免疫。转化生长子（TGF-）能抑制各类淋巴细胞增殖和发挥功能，T细胞活化时TGF-减少，则抑制免疫球蛋白合成的功能减弱，从而导致B细胞活性增强、免疫球蛋白合成增多。青蒿琥酯可使狼疮样小鼠血清中原升高的IL-6明显降低、而使TGF-基本恢复正常 ；青蒿琥酯亦可使狼疮样小鼠肾脏组织中IL-6降低,而肾小球上皮细胞表达明显增强的TGF-在治疗后轻度下降。提示青蒿琥酯可能通过直接或间接影响体内IL-6和TGF-的表达，调节SLE的异常免疫反应而起到治疗作用。血管内皮生长因子（VEGF）又名血管通透因子，在肾小球内皮细胞、足突细胞、肾小球系膜细