林下山参与园参中腺苷和人参皂苷含量比较分析.docVIP

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免费文档下载/本文档下载自文库下载网，内容可能不完整，您可以点击以下网址继续阅读或下载：/doc/ed95133eaf1ffc4fff47ac07.html林下山参与园参中腺苷和人参皂苷含量比较分析药物分析杂志ChinJPharmAnal2010,30(9)1701林下山参与园参中腺苷和人参皂苷含量比较分析何绍玉,李伟,郑毅男,王启军11123(11吉林农业大学中药材学院,长春130118;21华南理工大学轻工与食品学院,广州510640)摘要目的:探索不同生长年限林下山参和园参中腺苷和主要人参皂苷类成分的差异,探讨评价林下山参和园参质量的理化指标。方法:以914年生的林下山参和36年生的园参为材料:用15%甲醇超声提取,采用反相高效液相色谱法分析研究-1其中腺苷含量差异,色谱柱为YMCC18(150mm610mm,5m)柱,流动相为甲醇-水(1090),流速017mL?min,检测波长260nm,柱温45;用甲醇回流提取,反相高效液相色谱法分析研究其中的人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd6个成分进-1行含量测定,色谱柱为YMCC18(150mm610mm,5m)柱,流动相为乙腈-水梯度洗脱,流速115mL?min,检测波长203nm,柱温30。结果:建立了人参中腺苷的检测方法并测得不同生长年限林下山参和园参中腺苷含量为0117001582mg?g;优化了人参中主要人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd的检测方法,而且还测得不同生长年限林下山参和园参-1中这6个皂苷的含量为1511854174mg?g-1。结论:园参中腺苷含量明显高于林下山参,不同年生的园参中腺苷含量除3年生的含量较高外,其余的无显著差异;不同年生的林下山参中腺苷含量随年龄的增长而降低,林下山参与园参中腺苷含量存在极显著差异。6个人参皂苷总量在林下山参和园参中的含量都随年龄的增长而增高,除9年生的林下山参稍低外,其余的林下山参皂苷含量均高于园参。关键词:林下山参;园参;腺苷;人参皂苷;含量比较中图分类号:R917文献标识码:A文章编号:0254-1793(2010)09-1701-06Compar/doc/ed95133eaf1ffc4fff47ac07.htmlativelyanalyzethesenosidesinsemiginginseng,ZHENGYi-nan,WANGQi-jun11123ofMaterialMedicine,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;21SouthUniversityofTechnologyCollegeofLightIndustryandFoodSciences,Guangzhou510640,China)AbstractObjective:Tostudythedifferencecontentofadenosineandmainginsenosidesbetweendifferentyearssemi-wildginsengandcultivatedginseng,searchforandestimatethequalitycontrolstandardofsemi-wildgin2sengandcultivatedginseng1Methods:Adenosinewereextractedinmethanol(15%)placedintoanultrasonicbathandthedifferenceofitscontentbetween9-14yearssemi-wildginsenggrowninQingheand3-6yearscultivat2edginsenggrowninZuojiawerestudiedusingRP-HPLC,YMCC18(150mm610mm,5m)columnwasadopt2ed,themobilephasewasmethanol-water(1090)attheflowrateof017mL?min-1,thedetectionwavelengthwas260nm,andthecolumntemp/doc/ed95133eaf1ffc4fff47ac07.htmleraturewas451GinsenosideswereextractedwithmethanolandthecontentsofthemajorginsenosidesRg1,Re,Rb1,Rc,Rb2andRdwerequantifiedusingRP-HPLC,YMCC18(150mm610mm,5m)columnwasadopted,themobilephasewasacetonitrile-waterwithgradientelutionattheflowrateof115mL?min-1,thedetectionwavelengthwas203nm,andthecolumntemperaturewas301Results:AnHPLCmethodfordeterminingthecontentofadenosineinginsengwasestablished,andthemethodforginsenosidesanalysisinginsenghavebeenimproved1Insemi-wildginsengandcultivatedginsengwithdifferentage,thecontentofaden2-1osinewas01170-01582mg?g,andthecontentof6mainginsenosides(Rg1,Re,Rb1,Rc,Rb2,Rd)was15118-54174mg?g1Conclusion:Theadenosinecontentsofcultivatedginsengareapparentlyhigherthansemi-wildginseng1Exceptforthe3yearscultivatedginsenghasrelativelyhighadenosinecontent;theadenosine-1contentsofdifferentagescultivatedginse/doc/ed95133eaf1ffc4fff47ac07.htmlnghasnosignificantdifferences1Withthegrowthofage,theadenosine3通讯作者Tel:(020)87113848;E-mail:qjwang80201261com1702药物分析杂志ChinJPharmAnal2010,30(9)contentsofsemi-wildginsengaredecreasing,theadenosinecontentsofsemi-wildginsengandcultivatedginsenghavesignificantdifferences1Inpresentstudy,withthegrowthofagethetotalcontentsofsixginsenosidesbothofsemi-wildginsengandcultivatedginsengwereincreasing,exceptthatof9yearssemi-wildginsengarelower,oth2erstotalcontentsinsemi-wildginsengareallhigherthanthatofcultivatedginseng1Keywords:semi-wildginseng;cultivatedginseng;adenosine;ginsenosides;comparativecontent人参为五加科植物人参(PanaxginsengC1A1Mey)的干燥根及根茎,性平,具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津、安神、益智功能。近年来林下山参作为资源日趋枯竭的野山参的替代品,种植与应用日益广泛,其价格是园参的几倍甚至于几十倍,因此急需探索其人参的有效成分随生长年限变化的规律,寻找区分林下山参与园参的特征性指标。近年来药理研究表明,腺苷具有舒张血管、减慢心律、抑制血小板聚集等生理活性,同时还具有3触发或介导缺血预适应等心脏保护效应。目前腺苷含量已成为许多药材或滋补品质量监控的指467标。张永鹤等从人参芦头中分/doc/ed95133eaf1ffc4fff47ac07.html离出腺苷,说明人参中存在腺苷。方秋国等报道野生冬虫夏中腺苷的含量。量也存在差异。1的重要指标l和Re含量之和不少于0130%,Rb1012%作为人参药材质量控制的理化指标,未规定区分园参和林下山参质量的理化指标。目前已从人参根中分离得到25种人参皂苷,其中有关人参中人参皂昔Rg1、Re、Rbl、Rc等常见人参皂苷的鉴定或含量测定方面的研究较多,有关林下山参与园参药用成分差异的研究极少。本试验以辽宁省清河9,11,14年生的林下山参和吉林省左家3,4,5,6年生的园参为试材,用HPLC法测定林下山参、园参的腺苷和6个人参皂苷化合物含量,并比较了不同年生人参中腺苷和人参皂苷含量的变化趋势,为进一步提高和完善人参质量控制标准提供参考依据。并从化学成分含量差异,为区别林下山参、园参提供理论依据。1仪器与试药Agilent1100系列高效液相色谱仪(G1322ADEGASSER;G1311AQuatPump;G1318ACOLCOM;G1314AVWD,Chemistationsystem工作站)。82l甲醇、乙腈为TEDIA公司产品,色谱级;纯净水为娃哈哈公司产品;其他试剂为分析纯。林下山参采自辽宁清河、吉林浑南,园参采自辽宁清河和吉林抚松,均经吉林农业大学中药材学院郑毅男教授鉴定。2溶液制备211对照品溶液21111腺苷对照品储备液精密称取恒重后的腺苷对照品11123mg,用流动相甲醇-水(1090)溶解,并定容于50mL量瓶中,即得对照品储备液。21112人参皂苷对照品储备液Rgl、Rel2Rd各2mg,分别-,各取5mL放到,21将鲜人参样品洗净,每根分别按产地及生长年限逐根编号,50条件下烘干,粉碎(过3号筛),干燥条件下保存。21211腺苷供试品溶液取样品粉末(过3号筛)约015g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加入15%(v/v)甲醇20mL,超声(250W,40kHz)处理30min,过滤,滤渣再用15%(v/v)甲醇20mL超声(250W,40kHz)/doc/ed95133eaf1ffc4fff47ac07.html处理30min,滤过,合并滤液,减压浓缩至干,提取物用流动相甲醇-水(1090)溶解并定容至10mL量瓶中。取适量,过0145m滤膜,备上机用。21212人参皂苷供试品溶液取样品粉末(过3号筛)约012g,精密称定,用滤纸包好,编号,于索氏提取器内用氯仿50mL脱脂3h,挥干滤纸包,然后再用50mL甲醇于索氏提取器内在80条件下提取10h,加压浓缩提取液至干,提取物用乙腈-水(1882)溶解并转移至5mL量瓶中,定容。取适量,过0145m滤膜,备上机用。3色谱条件311腺苷测定色谱条件色谱柱:YMCC18(150mm610mm,5m)柱;流动相:甲醇-水-1(1090);流速:017mL?min;检测波长:260nm;对照品腺苷购于NewJerseys1USA,纯度9918%;人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd为实验室自制,纯度均高于98%。柱温:45。在上述色谱条件下,分别取对照品溶药物分析杂志ChinJPharmAnal2010,30(9)1703液、供试品溶液各20L注入色谱仪,记录色谱图(图1)。腺苷峰和相邻色谱峰的分离度大于115,理论塔板数以腺苷峰计算不低于3000,保留时间约为15114min。4线性关系考察用10%甲醇和18%乙腈分别将腺苷对照品储备液和人参皂苷对照品储备液各稀释2,4,8,16,32,64倍,分别过滤后,分别在各自的色谱条件下进样20L,以峰面积(Y)为纵坐标,对照品质量浓度(X)为横坐标进行回归。结果腺苷及人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd的回归方程分别为:Y=7116110X-2181r=019999Y=1109810X 34103r=019999Y=1112310X 32152r=019999Y=1162810X 54151r=019999Y=1156310X 46186r=0/doc/ed95133eaf1ffc4fff47ac07.html19999Y=1109810X 34103r=019999Y=95017X 13150r=019999333333图1腺苷对照品(A)和14号样品(B)色谱图Fig1Chromatogramsofadenosinereferencesubstance(A)andsampleNo114(B)11腺苷(adenosine)312人参皂苷测定色谱条件色谱柱:YMCC18(150mm610mm,5m)柱;流动相:乙腈(线性范围分别为0102311446,0131811944,0130611836,0131211872,0130911854,0131211872,0124611476g。5在“311”项色次,结果腺苷峰面积的RSD(75%;另取人参皂苷对照品溶液,在“312”项色谱条件下连续进样5次,结果人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd峰面积的RSD(n=5)分别为0171%,0156%,0189%,0183%,0178%,0181%。结果表明仪器精密度良好。6稳定性试验取同一腺苷供试品溶液,在0,2,4,6,8,10h分别按“311”项色谱条件进样20L,记录峰面积,结果腺苷峰面积的RSD(n=6)为111%;另取同一人参皂苷供试品溶液,在0,2,4,6,8,12h分别按“312”项色谱条件进样20L,记录峰面积,结果人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd峰面积的RSD(n=6)分别为0189%,0178%,0181%,0183%,0178%,0158%。结果表明,腺苷供试品溶液和人参皂苷供试品溶液在12h内均具有良好的稳定性。7重复性试验取同一人参样品5份,分别按“21211”项下方法制备腺苷供试品溶液,在“311”项色谱条件下进样20L,测得样品中腺苷含量平均值(n=5)为-101534mg?g,RSD为112%。取同一人参样品5份,分别按“21212”项下方法制备人参皂苷供试品溶液,在“312”/doc/ed95133eaf1ffc4fff47ac07.html项色谱条件下进样20L,测得样品中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd含量平均值(n水(B),梯度洗脱(024min:A;26min:24%A30AA;3050A5P55min:-13315%A:15mL?min;检测波长:203nm;柱温:30。在上述色谱条件,分别取对照品溶液、供试品溶液各20L注入色谱仪,记录色谱图(图2)。各人参皂苷峰和相邻色谱峰的分离度115;理论塔板数以人参皂苷Re峰计算不低于3000;人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd保留时间分别约为2218,24105,36176,38125,41107,47178min。图2人参皂苷对照品(A)与14号样品(B)色谱图Fig2Chromatogramsofginsenosidesreferencesubstances(A)andsam2pleNo114(B)人参皂苷(ginsenosides):11Rg1;21Re;31Rb1;41Rc;51Rb2;61Rd1704药物分析杂志ChinJPharmAnal2010,30(9)-1=5)为3185,2197,4124,4109,3168,2135mg?g;RSD分别为112%,116%,119%,116%,211%,116%。结果表明分析方法重复性良好。8加样回收试验-1精密称取已知腺苷含量(01534mg?g)的人参116%,116%,114%,114%,116%。9样品测定分别精密吸取腺苷对照品溶液(18108g?-1mL)与腺苷供试品溶液各20L,在“311”项色谱条件下进样分析,计算腺苷的含量,结果见表1;分-1别精密吸取人参皂苷对照品溶液(40g?mL)与人参皂苷供试品溶液各20L,在“31/doc/ed95133eaf1ffc4fff47ac07.html2”项色谱条件下进样分析,计算人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd的含量,结果见表1和图3。结果表明腺苷在林样品约0125g,共6份,分别精密加入与样品中腺苷含量相当的腺苷对照品,按“21211”项下方法制备供试溶液,在“311”项色谱条件下进样20L进行分析,计算腺苷加样回收率(n=6)为9917%,RSD为118%。另精密称取已知人参皂苷含量(Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd含量分别为3185,2197,4124,4109,-13168,2135mg?g)的人参样品约011g,共6份,分别精密加入与样品中各人参皂苷含量相当的对照品,按“21212”项下方法制备供试溶液,在“312”色谱条件下进样20L进行分析,计算人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd加样回收率(n=6)分别为10213%,10017%,9913%,10112%,10019%,10115%;RSD分别为110%,下山参中的含量远远低于园参。林下山参中腺苷随年龄的增加变化趋势很大,但园参中除3年生园参中腺苷含量明显高于其他年限的园参外,46年生的园参中腺苷含量基本一致。随着生长年限的增加园参中人参Rg1、Rb1和Rg1 Re的含量都有所增高,人参Rg1 Re Rb1增高的趋势更为明显。林下山参中人参皂苷含量总体上也是与年龄成正相关,但个体差异很大;6表1样品的测定结果(gg-1Tab1(样品号(sampleNo.)123456789101112131415161718192021腺苷(adenosine)平均值(average)18.923种类(产地()(age)333444555666Rg13.862.311.181.973.851.432.771.432.135.393.824.002.964.483.502.419.767.02Re2./doc/ed95133eaf1ffc4fff47ac07.html973.022.553.132.973.261.993.263.861.823.16()Rb85.744.246.936.076.936.478.269.72Rc4.093.942.673.954.093.864.833.864.923.674.83Rb23.682.113.413.413.684.813.134.813.923.845.533.911.383.862.321.077.846.103.855.058.08Rd2.354.521.491.92.351.491.84.732.871.641.632.531.461.360.931.272.652.901.531.562.11加和量(total)21.1920.4015.1820.1021.1821.7820.5925.0224.1724.6229.6932.9722.7820.0221.7821.4137.5242.4835.2154.7950.84含量(content)0.5820.6250.538平均值(average)0.5823(ginseng)左家(Zuojia)21.0230.4720.4990.3790.450323.2630.4860.4220.4740.461329.0930.4410.4560.4410.44634.1410.647.753.879.363.75林下参(semi-wildginseng)清河(Qinghe)9999111111141421.230.3470.3630.3560.3640.3583://doc/ed95133eaf1ffc4fff47ac07.htmlr4.4916.524.513.163.908.497.543.354.455.1012.506.235.9415.516.932.806.363.0638.430.2730.2080.2020.22836.8521.749.845.7721.366.5052.8230.1580.1820.1703注(note):3p药物分析杂志ChinJPharmAnal2010,30(9)1705洗脱梯度和流速,使其55min就能分析完人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd,节约了分析时间。1015腺苷与生长年限变化规律探讨本研究测定结果表明,林下山参与园参中腺苷含量存在极显著差异,林下山参中腺苷含量远低于园参,这与方秋国报道8的野生冬虫夏草中腺苷的含量远远低于人工培养的虫草一致。林下山参中腺苷含量随年龄的增加而急剧降低。3年生园参中腺苷含量最高,而图3不同年生园参和林下山参中Rg1、Re和Rb1分布情况Fig3ThecontentsdistributionofginsenosidesRg1,ReandRb1incul2tivatedginsengandsemi-wildginsengwithdifferentages商品作货的46年生园参中腺苷含量基本一致。乌云等13,14报道腺苷对马铃薯的块茎形成有促进作用,且不同光照条件下马铃薯各部位中腺苷含量也有所不同。腺苷在核苷磷酸激酶的作用下与三磷酸腺苷(ATP)反应,能生成5-磷酸腺苷(5-AMP)。5-AMP与二甲丙烯二磷酸(DMAPP)在一10/doc/ed95133eaf1ffc4fff47ac07.html讨论1011腺苷供试品溶液制备方法的选择以腺苷的含量作为指标,考察了文献9,10中加热回流法和超声法的提取效率。结果表明,二者提取率无明显差别,而超声法操作简便,故采用超声法。又考察了提取溶剂种类、用量和提取时间对提取效率的影响,最后选择最佳提取方法,为40倍量体积分数15%的甲醇超声提取30min,提取2次。1012腺苷色谱条件的选择2005年版一部“系列酶的催化下能生成玉米素、异戊烯基腺嘌呤等天然细胞分裂素。彭福天等15,从而使果,光照适而林下山参在自然状态下生长于,营养供给和光照都受到限制,所以园参的腺苷含量明显高于林下山参。因此作者认为腺苷可作为区别园参和林下山参的1个特征性指标。1016人参皂苷与生长年限的变化规律探讨吴广,经试验,以甲醇-水-1(1090),流速017mL?min,柱温45时,人参中腺苷可和其他组分基线分离,并且峰形良好,并避免了磷酸缓冲盐等物质对色谱柱的损害。1013人参皂苷的供试品溶液制备方法实验考察宣等用比色法和HPLC法对吉林抚松产的10,20,40年的野山参(全须参,各1份)与园参(全须16参,2份)进行了分析比较,研究结果表明总皂昔含量野山参高于园参。本研究也证明林下山参中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2和Rd的总量高于园参。F1Soldati17了微波辅助、热回流、索氏回流、超声、快速溶剂萃取(ASE)、超高压、高压静电共7种提取方法,分别测人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd的提取率。结果表明索氏回流提取法对这6个人参皂苷提取率最高。然后用正交试验确定以50mL甲醇于索氏提取器中在80条件下提取10h为最佳处理方法。1014人参皂苷色谱条件的选择目前国内外应用对生长在日本和朝鲜的16年/doc/ed95133eaf1ffc4fff47ac07.html人参100多个样品分析,发现人参皂苷的含量随生长年限的增长而不断升高。本研究也证明园参中人参皂苷Rg1、Rb1和Rc以及6个主要人参皂苷(Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2和Rd)的总和也随生长年限的增长而高效液相色谱法测定人参皂苷含量的研究报道较多,大多使用乙腈-磷酸盐为流动相11,12逐渐升高。林下山参中各单体人参皂苷含量波动较大,可能是因为林下山参比园参生长环境开放、多变,体内代谢强弱变幅大,直接反映到根中次生代谢物的量,同时也与其参须、芦头和主根在整支参中所占比例有关。参考文献1ChP(中国药典)120051Vol(一部):72ZHAOJing-lin(赵京林)1Theresearchadvancementofadenosine,而且分析人参中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd的分析时间长达100min。本实验未用磷酸盐,直接用乙腈-水作流动相,避免了磷酸盐对色谱柱损耗大,系统清洗麻烦等问题。用直径为610mm的色谱柱作为分析柱,增大了分析样品的承受量,降低了最低检出限。在实验室原有条件的基础上,调整了流动相1706药物分析杂志ChinJPharmAnal2010,30(9)的含量)1ChinJPharmAnal(药物分析杂志),2006,26(11):166511XUChuan-lian(许传莲),ZHENGYi-nan(郑毅男),CUIShu-yu(崔淑玉),etal1DeterminationofsixginsenosidesinleavesandstemsofPanaxquinuefoliumL.byRP-HPLC(RP-HPLC法andmyocardialprotection(腺苷与心脏保护的研究进展)1ChinJCardiovascRev(中国心/doc/ed95133eaf1ffc4fff47ac07.html血管病研究杂志),2004,2(8):6583ZangWei-jin,SunLei,YuXiao-jiang1Cardioprotectionofische2micpostconditioningandpharmacologicalpost-treatmentwitha2denosineoracetylcholine1ActaPhysiolSin,2007,59(5):5934XUDuan-qiong(徐端琼),NIYi-dan(倪怡丹)1DeterminationofadenosineinmyceliumfromcultureCordycepicbyHPLC(高效液测定西洋参茎叶中6种人参皂苷的含量)1JJilinAgricUniv(吉农业大学学报),2002,24(3):512HEBin(贺彬),LIAOQing-wen(廖庆文),XINGXie-wang(邢相色谱法测定人工虫草菌丝体中腺苷的含量)1RenshenYanjiu(人参研究),2007,(2):215GUOLi(郭力),LIANGHeng-xing(梁恒兴),ZHAOBin(赵协望)1DeterminationofginsenosidesinShengegranulessimultane2ouslybyHPLC(参葛颗粒中多种人参皂苷的HPLC测定)1GuidJTraditChinMedPharm(中医药导报),2005(5):60斌),etal1DeterminationofadenosineinRadixIsatidisandFoliumIsatidismedicinalsubstances(板蓝根和大青叶类药材腺苷含量的13WUYun(乌云),LIBing-zhen(李秉真),LIUMeng-yun(刘梦测定)1ChinTraditPatMed(中成药),2006,28(7):7://doc/ed95133eaf1ffc4fff47ac07.htmlar6DENGLi-ming(邓丽明),DENGHong(邓红),LINHua-qing(林华庆),etal1Determinationofadenosineinanti-virusoralso2lutionsbyHPLC(高效液相色谱法测定抗病毒口服液中腺苷含芸)1Theeffectofthechangeofadenineandadenosineindifferentphotoperiodsontheformationofpotatotubers(马铃薯中6-氨基嘌呤和腺嘌呤核苷在不同光照条件下的变化与块茎形成的研究)1ChinPotatoJ(马铃薯杂志),1995,9(2):7414TiessenA,HendriksJH,StittM,etal1Starchsynthesisinpotatotu2bersisregulatedbypost-translationalredoxmodificationofADP-glucose