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中宇宙法研究土霉素残留对底泥细菌耐药性的影响作者：陈晓梅摘要：人工模拟多个池塘生态环境，即中宇宙来研究不同浓度的盐酸土霉素对池塘生态系统中底泥弧菌的耐药特性的影响，同时了解耐药菌对四环素类抗生素的交叉耐药性。从而为尚处于起始阶段的抗生素环境安全评价工作提供基本的数据。关键词：中宇宙；盐酸土霉素；底泥；耐药性；交叉耐药性前 言随着集约化畜牧业的发展，抗生素的应用也越来越多。这些抗生素能防治疾病和促进动物生长，但是应用于动物的抗生素能以原形或代谢物形式随粪便排泄到环境中。由于抗生素的生物活性，进入环境中的抗生素可作用于环境生态系统的各个层面，并最终将对人类的生存环境和健康造成不利影响13。目前普遍认为在抗生素残留对环境的诸多影响中，抗生素对环境细菌的耐药性的选择和诱导以及这种耐药性在时空上的传播是其最重要的一面，同时也是与人类公共卫生关系最为密切的一面4。水环境作为畜牧和水产用药的最终归宿地，常常积累了大量的抗生素残留，因此水环境可能作为环境耐药细菌的重要储库而在研究上具有特殊重要的意义57。目前国际上普遍采用模拟生态系统的方法来研究外来化学物质对环境的影响。其中，中宇宙是指体积大于1m3的模拟生态系统8，9。该方法可以很好地模拟田间环境同时可以排除田间试验的各种干扰因素，使试验结果具有更好的可比性。本试验选择在畜牧和水产生产上广泛应用的土霉素来研究其对模拟池塘生态系统中的底泥弧菌的耐药特性的影响，以期为今后的抗生素残留环境安全性评价工作积累基本数据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 药物和试剂盐酸土霉素，江西国药股份有限公司，批号：0202060， 含量84.9%盐酸四环素，四川制药，批号：PX-2TCH 2246B, 988.8/mg强力霉素，上海五洲，批号：HS0130, 842/mg米洛霉素，苏州立达，批号：TE27, 1000/mgTCBS琼脂，批号200207104，广东环凯微生物科技公司营养肉汤，批号20020403，杭州天和微生物试剂有限公司1.1.2 仪器水平摇床，HS 250 B型，马来西亚IKA公司电子分析天平，AE160型，瑞士Mettler公司1.2 方法1.2.1 池塘中宇宙模拟生态系统的建立1.2.1.1 中宇宙的建立和调试建立6个高为1m，体积为5.3m3的水泥壁小池塘；等份加入未曾接触过抗生素的养鱼池底泥，同时加入等体积的水，自然光照，适当添加水至系统成熟。1.2.1.2 测试指标及系统成熟的标志系统成熟前每周测定溶解氧、pH值、水温等参数,每周用黑白瓶法测定系统昼夜呼吸率以推算P/R值。不同系统各项指标的变异系数小于20%30%即可认为系统稳定。1.2.1.3 实验分组及用药在系统中符合要求的5口池塘进行试验，分别设一个空白对照组和四个用药组。盐酸土霉素用药浓度分别相当于土霉素0.8g/ml、4.0g/ml、20.0g/ml、100g/ml。先将药物溶解于洁净桶中，全池泼洒并适当混匀。各中宇宙药物浓度如下：表1 各中宇宙药物浓度中宇宙ABCDE用药浓度0g/ml0.8g/ml4.0g/ml20.0g/ml100g /ml1.2.2 水体中底泥样品的采集和弧菌的分离培养1.2.2.1 采样器的制作根据Samuelsen（1992）的文献10制作底泥采样器。1.2.2.2 采样的时间和方法在用药前一天、用药后第21d、用药后第70d分别在各中宇宙中分10个点采集柱状泥样，缓慢地将泥柱推入洁净的白瓷盘中。1.2.2.3 水体底泥样品的处理取并列排放于白瓷盘的10个泥柱的前2cm于封口胶袋中混合均匀，分别取出15g于250ml的灭菌锥形瓶中，加入100ml的灭菌蒸馏水，于水平摇床上以275rpm振荡10min后，静置10min，再将上清液倾入另一250ml的灭菌锥形瓶。1.2.2.4 弧菌的分离培养方法将上述各中宇宙的上清液用灭菌蒸馏水稀释101000倍。取0.2ml稀释液缓慢加入事先制备好的TCBS琼脂上，用无菌三角形玻璃推刀将稀释液推至均匀。再将上述TCBS琼脂倒置,在25培养箱中培养20h,观察细菌生长情况。在TCBS培养基上长成的深绿色、半透明、外圈有白晕的中等大小的菌落为优势菌落。挑取优势菌落分别接种于5ml灭菌营养肉汤中培养48h。1.2.3 土霉素对弧菌耐药性的影响1.2.3.1 盐酸土霉素药液的配制准确称取适量盐酸土霉素于100ml容量瓶中，加蒸馏水定容，充分混匀，配成浓度为1280g/ml的储备液，4冰箱中保存。临用前以0.22um的滤膜除菌。1.2.3.2 药物敏感性试验取10ml灭菌试管6支。将菌液用营养肉汤稀释至约为105个细菌/ml，除第一管加入稀释菌液1.8ml外，其余各管均加入1.5ml，然后向第一管加入1280g/ml盐酸土霉素0.2ml，混匀后，吸出0.5ml加入到第二管。同样方法依次稀释到第5管，弃去0.5ml，第6管为药物空白对照管。6支试管的药物浓度分别为：128g/ml、32g/ml、8g/ml、2g/ml、0.5g/ml、0ug/ml。稀释完毕后，盖好试管，置25培养箱中培养20h后观察结果。每株受试细菌分别做2次重复。1.2.3.3 结果判断取出试管逐支摇匀后观察。若培养液中含有絮状物沉淀或不澄明的管判为有细菌生长；以澄清透亮的管判为无细菌生长。无细菌生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)。如果6支试管全部有细菌生长，则说明池塘生态中的弧菌对土霉素的MIC128g/ml（第1管的药物浓度）。1.2.4 耐药菌交叉耐药试验1.2.4.1 各种药液的配制按1.2.3.1的方法配制浓度为1280g/ml的四环素、强力霉素、米洛霉素的储备液。视情况进行不同的稀释。1.2.4.2 交叉耐药性试验选取以上药物敏感试验中的敏感弧菌和耐药弧菌分别研究其对四环素、强力霉素、米洛霉素的敏感性，以考查底泥耐药弧菌对同类药物的交叉耐药程度。取10ml灭菌试管9支。将菌液用营养肉汤稀释至约为105个细菌/ml。除第一管加入稀释菌液1.8ml外，其余各管均加入1.5ml，然后向第一管分别加入1280g/ml药液0.2ml，混匀后，吸出0.5ml加入到第二管。同样方法依次稀释到第8管，弃去0.5ml，第9管为药物空白对照管。那么，这9支试管的药物浓度分别为：128g/ml、32g/ml、8g/ml、2g/ml、0.5g/ml、0.125g/ml、0.031g/ml、0.008g/ml、0g/ml。稀释完毕后，盖好试管，置25培养箱中培养20h后观察结果。每种药物对于每株受试细菌分别做2次重复。1.2.4.3 结果判断取出试管逐支摇匀后观察。若摇荡试管发现有絮状物沉淀或不澄明的管判为有细菌生长；以澄清透亮的管判为无细菌生长。无细菌生长的最低浓度为最低抑菌浓度（MIC）。如果9支试管全部有细菌生长，则说明：池塘生态中弧菌对该抗生素的敏感度128g/ml（第1管的药物浓度）。2 结果2.1 土霉素对中宇宙弧菌耐药性的影响2.1.1 用药前中宇宙A、B、C、D、E中的弧菌对土霉素耐药情况见表2：表2 用药前各中宇宙特征弧菌在不同水平MIC时菌株数中宇宙试验菌株数各MIC值的菌株数128g/ml128g/ml32g/ml8g/ml2g/ml0.5g/mlA3543331210B363123261C381312301D373426211E58043530162.1.2 用药后第21d中宇宙E分离不出特征弧菌，中宇宙A、B、C、D中弧菌对土霉素耐药情况见表3：表3 用药后21天各中宇宙特征弧菌在不同水平MIC时菌株数中宇宙试验菌株数各MIC值的菌株数128g/ml128g/ml32g/ml8g/ml2g/ml0.5g/mlA230703121B25821671C293163115D26111102112.1.3 用药后第70d中宇宙E分离不出特征弧菌，中宇宙A、B、C、D中弧菌对土霉素耐药情况见表4：表4 用药后70天各中宇宙特征弧菌在不同水平MIC时菌株数中宇宙试验菌株数各MIC值的菌株数128g/ml128g/ml32g/ml8g/ml2g/ml0.5g/mlA390002334B4011270020C340188323D4034202202.1.4 以中宇宙D在用药前的10株弧菌和用药后第21d分离得到的14株弧菌来研究其对四环素、强力霉素、米洛霉素的交叉耐药性，其试验结果见表5：表五 四环素类药物交叉耐药试验结果药物名称时间各MIC值的菌株数12812832820.50.1250.0310.008四环素用药前000002800用药后176000000强力霉素用药前000000910用药后0002111000米洛霉素用药前0000001000用药后002273000注：1280.008的单位为g/ml。2.2 对药物敏感性试验结果的分析2.2.1 以MIC=2g/ml为基准，则敏感度大于16g/ml的菌株为耐药菌株。以这个标准来分析用药前后弧菌对土霉素敏感程度，反映了土霉素明显诱导中宇宙中弧菌的耐药性。表6 细菌耐药率变化表中宇宙用药前用药后第21天用药后第70天试验株耐药株耐药率试验株耐药株耐药率试验株耐药株耐药率A351028.57%23730.43%3900%B36616.67%251144.0%403895.0%C38513.16%291034.48%302686.67%D371129.73%262284.62%403690.0%E58712.07%注：用药后在E中宇宙中分离不到优势弧菌。用t检验比较用药前和用药后21天的耐药菌株数，发现空白对照组（A）在用药前后的耐药率差异不显著（P0.05）；而用药组除E组分离不出优势细菌外，用药前后的耐药率均差异极显著（P0.01）。2.2.2 以MIC=0.125g/ml为基准，则敏感度大于1.000g/ml的菌株为耐药菌株。用这个标准来比较和分析池塘生态中弧菌在用药前后对不同的四环素类药物的敏感程度，可以明显观察到交叉耐药现象。表7 细菌交叉耐药试验结果药物名称用药前用药后第21天试验株耐药株耐药率试验株耐药株耐药率四环素1000%1414100%强力霉素1000%141392.86%米洛霉素1000%141178.57%3 讨论在实验过程中，施药前中宇宙E中能分离到大量的特征弧菌，而在用药后则分离不到特征弧菌；这可能是因为高剂量的药物杀灭了该特征细菌。中宇宙B、C、D中的特征弧菌均明显地对土霉素产生耐药性。但是从各宇宙在用药前后的耐药率比较看，耐药率并没有同药物浓度之间呈现出良好的相关性，这一现象与ORelly（2001）等11的报道是一致的，其原因可以解释为药物在底泥环境中能够与金属离子结合而抑制其活性，使耐药率与用药浓度之间无法形成有效的规律性。本试验中在用药后第70d分离所得的弧菌对土霉素的耐药率呈明显的上升趋势且耐药水平也有升高的趋势。该现象可以解释为：底泥中药物不易发生降解和转移，长期的药物存在可以对弧菌诱导产生耐药性并诱导出高水平耐药株。交叉耐药性试验表明：诱导出的耐药株对四环素类药物具有明显的交叉耐药现象。其中对四环素是完全交叉耐药，而对强力霉素和米洛霉素为高水平交叉耐药。存在以上区别可能是这些药物不同的耐药机制所致。本实验结果表明：单剂量给予不同浓度的土霉素都能对池塘生态系统中特征性耐药弧菌具有明显的选择作用，且由于药物长期存在于底泥环境，不容易发生降解和转移，使底泥中可以长期维持高水平的耐药菌的存在。对于多剂量给药本实验并没有进行研究，但多剂量给药所造成的环境危害性必然更加严重。有研究认为细菌对四环素类抗生素产生耐药性的三个主要机制都是通过质粒介导的。细菌中的土霉素耐药质粒能够在不同的气单胞菌和大肠杆菌之间进行转移，并最终在特定的地理区域的人和水环境之间传播。这些充分说明了抗生素的大量使用使环境不仅成为耐药基因的储库，也成为耐药基因扩散和演化的媒介。本试验结合目前国际上的相关报道说明了在畜牧业和水产养殖业上广泛使用的土霉素对环境有潜在的不利影响。人们在使用土霉素等抗生素药物来预防、治疗动物疾病的同时，不仅仅要考虑其对动物机体病原菌的抗药性的影响，还要考虑随粪便或者尿液排泄到环境中的抗生素药物对环境可能产生的负面作用。致 谢本研究和实验过程是在兽医药理研究室杨桂香副教授和博士研究生俞道进同志的悉心指导和关怀下完成的。实验过程还得到了高级实验师叶启薇老师、研究生李西瑞、吴洁珊等的关心和赵健文同学的协助。谨此表示最衷心的感谢！【参考文献】1 陈杖榴，杨桂香，孙永学等. 兽药残留的毒性与生态毒理研究进展. 华南农业大学学报，2001，22（1）：8891.2 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