细胞生物学实验材料.doc

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orange）、蒸馏水、水葫芦叶片四、实验内容与方法（一）荧光显微镜的构造1、基本装置荧光显微镜的基本装置是由普通光学显微镜加上一些附件（如荧光光源 、激发滤片、二向色镜和阻断滤片等）的基础上组成的。荧光光源一般采用高压汞灯（50-200W），它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长 ，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断（或压制）滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛，二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。2、光路荧光显微镜就其光路来分有两种： 透射式荧光显微镜：激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视野集光器，也可用普通集光器，调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上这是比较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱所以对观察较大的标本材料较好。图2 落射式光路 落射式荧光显微镜：这是近代发展起来的新式荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。光路中需加上一个二向色镜，它与光铀呈45角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，返回到二向色镜，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片二向色镜阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。（二）荧光显微镜的使用1、使用方法：荧光显微镜使用时，一般先用普通的低压光源观察样品，确定了观察的部位后，再切换至激发光观察荧光，如配有照相装置还可进行显微摄影。 接通电源，按压稳压器按钮，使汞灯点亮；推上挡光板，滤片转换拨杆调至“O”，打开底座白光光源；装片放上载物台，用低倍至高倍白光观察，将需观察的样品置于光圈中央；关上底座光源，滤片转换拨杆调至“B”，推开挡光板，观察样品发出的荧光。2、注意事项： 最好在暗室中进行检验。汞灯接通电源后需要1015 min预热，汞才能充分汽化并形成汞弧，产生高亮度而稳定的激发光。待光源发出强光并稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。 检查时间以一次12 h为宜，如果超过90 min，高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受激发光照射35 min后，标本荧光也明显减弱，因此在使用激发光与可见光观察之间转换或暂停观察时，可拉动挡光板阻挡光线；标本染色后立即观察，时间久了荧光会逐渐减弱。 高压汞灯达到最大发光效率后，灯箱会发烫，操作需注意避免烫伤；灯箱上端为散热口，一定不能放置物品。 汞灯的使用寿命一般只有100 h，使用得当可达150 h，使用寿命与开关的次数成反比，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应打开电扇或空调散热降温。换新灯泡应从开始使用就记录时间。 关掉汞灯电源后，必须等待1520 min待汞灯自然冷却后才可再次接通电源，违反这一操作规定时，将会造成严重后果！（轻则烧断保险丝或烧毁汞灯电源中的扼流圈，重则汞灯爆炸）一天中应避免数次点燃光源。（三）简易荧光标本制作与观察1、装片制作用镊子撕取水葫芦叶片表皮（带绿色）置于载片上，滴加12滴蒸馏水或吖啶橙染液，加盖片后置显微镜下观察。 在普通光镜下观察。 在荧光显微镜下观察自发荧光和次生荧光。2、实验结果（1）在普通光镜下可以看到两种细胞 保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。 叶肉细胞：为排成栅状的长方形和椭圆形细胞。 叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。 （2）在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱。气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内叶绿体数量要比叶肉细胞少。（3）用吖啶橙染色后，叶绿体则发出枯红色荧光，细胞核可发出绿色荧光，气孔仍为绿色。图3 普通光镜下的保卫细胞和叶肉细胞 图4 荧光显微镜观察到的叶肉细胞五、思考题1、在荧光显微镜下观察叶绿体的自发荧光时，更换滤片系统，叶绿体的颜色是否有变化? 2、普通光镜与荧光显微镜有何异同点? 实验二 叶绿体的分离与荧光观察一、实验目的1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光并熟悉荧光显微镜的使用方法。二、实验原理叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的。由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法，一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。差速离心是利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。差速离心的分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。例如用差速离心法分离已破碎的细胞各组份。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。分离过程最好在 05的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。三、实验用品普通离心机、搅拌机、粗天平、荧光显微镜、250 ml烧杯、50 ml烧杯、200ml量筒、滴管、10 ml刻度离心管、玻棒、纱布、载玻片、盖玻片、新鲜韭菜、0.35mol/L氯化钠、0.01%吖啶橙、蒸馏水四、实验内容与方法1、选取新鲜的韭菜叶，洗净擦干后去除叶梗，称30 g于150 ml0.35 mol/L NaCl 溶液中，装入搅拌机。2、利用搅拌机2档（10000r/min）匀浆30 s。 3、将匀浆用8层纱布过滤于250 ml烧杯中。4、取滤液8ml 在1000r/min 下离心2min，弃去沉淀。5、将上清液在 3000r/min 下离心 5 min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞陔)。 6、将沉淀用15 ml的0.35mol/L NaCl 溶液悬浮。 7、取叶绿体悬液一滴于载片上，另取叶绿体悬液一滴滴在载片上，再滴加一滴 0.01%吖啶橙荧光染料，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。 在普通光镜下观察。 在荧光显微镜下观察。 8、实验结果图5 叶绿体的自发荧光 普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。 在选用B(blue)激发滤片，B双色镜和O530(orange)阻断滤片的条件下， 叶绿体发出火红色荧光。 加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧色。五、思考题1、游离叶绿体和整体细胞内的叶绿体，在荧光显微镜下，其颜色和强度有无差异？2、两次离心第一次去掉沉淀，第二次去掉上清液，分别去掉的是什么物质？3、叶绿体分离的实验原理是什么？在分离叶绿体时应注意些什么问题？ 实验三 线粒体的活体染色与观察一、实验目的1、观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。2、学习一些细胞器的超活染色技术。二、实验原理活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无害毒的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表现带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用。一般足以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、 胆固醇等)的特性，易于被细胞吸收。线粒体是细胞内的一个重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。不同细胞中线粒体的形态和数目不同。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。詹纳斯绿B（Janus green B）对线粒体具有专一性的染色，是毒性最小的碱性染料。Janus green B 染色是由于线粒体中的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态，呈蓝绿色，而周围的细胞质被还原成无色的色基。三、实验用品洋葱鳞茎、新鲜猪肝、普通光学显微镜、凹面载玻片、镊子、剪刀、载玻片、盖玻片、培养皿、滴管、解剖刀1、Ringer溶液： 氯化钠 8.5g （变温动物用 6.5g） 氯化钙 0.12g 碳酸氢钠 0.20g 氯化钾 0.14g 磷酸氢二钠 0.01g 葡萄糖 2.0g 加蒸馏水 至1000ml 2、1%1/5000 詹纳斯绿B（Janus green B）溶液 称取0.5g 詹纳斯绿B溶于50 ml Ringer溶液中，稍加热（3040）使之很快溶解，用滤纸过滤，即成1%原液。临用前，取1%原液，加入49 ml Ringer溶液混匀，即成1/5000工作液，装入棕色瓶备用，以保持它的充分氧化能力。四、实验内容与方法（一） 动物细胞线粒体活体染色的观察1、取样染色：取猪肝边缘较薄的肝组织一小块，放入盛有Ringer液的培养皿内，用吸管吸取Ringer液，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。 图6 肝细胞线粒体活体染色2、在干净的凹面载玻片的凹穴中滴加 1/5000 詹纳斯绿 B（Janus green B）溶液，再将肝组织块移入染液，但不可将组织块完全浸没，要让组织上面部分半裸露在外面，这样细胞内的线粒体酶系可充分得到氧化，易被染色。当组织块边缘被染成蓝绿色即可（一般需染2030 min）。3、分离细胞：染色后，吸去染液，滴加Ringer溶液，用眼科剪将组织块着色部分剪碎，使细胞或细胞群散出。图7 洋葱鳞茎内表皮细胞线粒体4、装片：用吸管吸取分离出的细胞悬液，滴一滴在载玻片上，盖上盖玻片，显微镜观察。在低倍镜下选择不重叠的肝细胞，在高倍镜下观察，可见具有l2个核的肝细胞质中，有许多被染成蓝绿色的线粒体，呈颗粒状或线条状，在细胞核周围分布特别多。（二）植物细胞线粒体的活体染色1、用吸管吸取 1/5000 詹纳斯绿B 染液，滴一滴在干净的载玻片上，然后用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块，置于染液中，染色 1015 min。2、吸去染液，加一滴 Ringer液，注意使内表皮展平，盖上盖玻片，显微镜观察。在高倍镜下，可见表皮细胞中央被一大液泡所占据，细胞核被挤至旁边，线粒体染成蓝绿色，呈颗粒状或线条状。五、思考题1、肝细胞线粒体活体染色实验的注意事项有哪些？2、线粒体为何在细胞核周围分布较多？ 实验四 细胞膜的通透性一、实验目的1、了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度，分析影响细胞膜的渗透性的因素。2、了解溶血现象及其发生机制。二、实验原理细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。渗透作用是细胞膜的主要功能之一。将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。渗透压相等的两种溶液称为等渗溶液。渗透压不同的两种溶液，把渗透压相对高的溶液叫做高渗溶液，把渗透压相对低的溶液叫做低渗溶液。对同一类型的溶质来说，浓溶液的渗透压比较大，稀溶液的渗透压比较小。因此，在发生渗透作用时，水会从低渗溶液（即稀溶液）进入高渗溶液（即浓溶液），直至两溶液的渗透压达到平衡为止。给伤病员进行大量补液时，常用与血浆等渗的0.154mol/L NaCl溶液（生理盐水），而不能用0.256 mol/L NaCl的高渗溶液或0.068 mol/L NaCl的低渗溶液。图8红细胞在不同浓度NaCl溶液中的形态示意图影响细胞膜的通透性的主要因素是跨膜转运物质自身的理化性质，脂溶性大、分子量小、不带电荷或非极性的分子比脂溶性小、分子量大、带有电荷或极性的分子更容易穿膜。一般认为，在简单扩散的跨膜转运中，涉及物质溶解在膜脂中，再从膜脂的一侧扩散到另一侧，最后进入细胞质水相中。所以，其通透性主要取决于分子大小和分子极性。本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。由于细胞对各种溶质的渗透性不同，有的溶质可渗入， 有的溶质不可以渗入，渗入的红细胞溶质可提高红细胞的渗透压，促使水分进入细胞，引起溶血。由于溶质分子的大小、极性不同，溶质渗入速度不同，因此溶血时间也不同。分子的极性、大小对物质透过细胞的速度有影响。当溶质不能自由透过细胞膜时，溶液的渗透压成为影响水分进出细胞的因素。当溶液渗透压小于细胞渗透压时，则水分进入细胞，使细胞膨胀甚至溶血；反之，细胞失水。三、实验用品新鲜鸡血（加抗凝剂）、50ml烧杯、试管、试管架、刻度吸管、秒表、载玻片、盖玻片、普通光学显微镜、记号笔、0.85%NaCl、0.15mol/L NaCl、0.065mol/L NaCl、0.035mol/L NaCl、0.005mol/L NaCl、0.8mol/L甲醇、0.8mol/L乙醇、0.8mol/L乙二醇、0.8mol/L丙醇、0.8mol/L丙二醇、0.8mol/L丙三醇四、实验内容与方法 1、血细胞悬液的制备取1份鸡血，加入10份的0.85%的NaCl（生理盐水），即为稀释的动物红细胞悬液（不透明的红色液体）。2、低渗溶血观察取试管1支，加入5mL蒸馏水，然后再加入0.5 ml红细胞悬液，晃动试管使之混匀，注意观察溶液的颜色变化，溶液由不透明的红色变为澄清，说明红细胞发生破裂，造成所有红细胞溶血，使光线容易通过（可以通过试管壁看清书上的字为标准）。记录溶血时间，显微镜下观察溶血前后红细胞的形态。3、血红细胞的渗透性实验 A组:0.15mol/L NaCl、0.065mol/L NaCl、0.035mol/L NaCl、0.005mol/L NaClB组:0.8mol/L甲醇、0.8mol/L乙醇、0.8mol/L乙二醇、0.8mol/L丙醇、0.8mol/L丙二醇、0.8mol/L丙三醇将试管编号，分别取A组试剂各5ml，加鸡血0.5ml，立即混匀，观察溶血与否，记录溶血时间，重复以上实验过程二次。制片进行显微镜观察。再分别取B组试剂各5ml，加鸡血0.5 ml，方法同上。由于有的醇溶血时间较快，并且溶血时间较接近，所以2支试管一组重复以上实验过程。五、思考题1、血红细胞的渗透性实验中，是否存在物质跨膜的主动运输现象？为什么？2、常用的抗凝剂的种类和作用机理是什么？3、已知四种等渗盐溶液分别为0.17 mol/L醋酸铵、0.17 mol/L硝酸钠、0.17mol/L氯化铵、0.12 mol/L草酸铵，试剂瓶上的标签被盖住了。如果用它们进行血红细胞的渗透性实验，你能否根据该实验结果确切判断出每一瓶中所装的是哪一种试剂？为什么？ 实验五 DNA的细胞化学Feulgen反应一、实验目的了解 Feulgen反应的原理，掌握有关的操作方法。二、实验原理DNA是由许多单核苷酸聚合成的多核苷酸，每个单核苷酸又由磷酸、脱氧核糖和碱基构成。DNA经 1 mol/L 盐酸水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的双键打开，使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基，这些醛基与Schiff试剂反应。Schiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠相作用，形成无色的品红液，当无色品红与醛基结合即形成紫红色的化合物。因此凡有DNA的地方，都能显示紫红色。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色基团，所以具有颜色。材料不经过水解或预先用热的三氯醋酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了Feulgen反应的专一性。图9 Feulgen反应三、实验用品普通光学显微镜、恒温水浴箱、温度计、试管、烧杯、载玻片、盖玻片、吸水纸、洋葱鳞茎1、Schiff试剂称取 0.5 g碱性品红加入到 100 ml煮沸的蒸馏水中（用三角烧瓶） ，时时振荡，继续煮 5 min（勿使之沸腾） ，使之充分溶解。然后冷却至 50 时用滤纸过滤，滤液中加入 10 ml1mol/L HCl HCl，冷却至 25 时，加入 0.5 g Na2S2O5（偏重亚硫酸钠或钾） ，充分振荡后，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少 24 小时（有时需 23 天） ，使其颜色退至淡黄色，然后加入 0.5 g活性炭，用力振荡 1min，最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。滤液应为无色也无沉淀，贮于 4 冰箱中备用。如有白色沉淀，就不能再使用，如颜色变红，可加入少许偏重亚硫酸钠或钾，使之再转变为无色时，仍可再用。2、亚硫酸水溶液取200ml自来水，加10ml10%偏重亚硫酸钠（或偏重亚硫酸钾）水溶液和 10ml1mol/L HCl，混匀。此溶液在使用前配制，否则会因SO2的逸出而失效。四、实验内容与方法1、酸解：将洋葱鳞茎内表皮放在60 1mol/L HCl中解离10 min。2、染色：用蒸馏水洗几次，Schiff试剂遮光染色30 min。3、制片：回收Schiff试剂，用新鲜配制的亚硫酸水洗3次，每次1 min，洗完后水洗5 min，在载玻片上铺平表皮，盖上盖玻片。4、观察：显微镜观察，细胞核或染色体被染成红色，细胞其余部分无色透明。 图10 洋葱鳞茎内表皮Feulgen反应 图11Feulgen反应对照结果对照片：方法一先将材料放在5 %三氯醋酸中90 水浴15 min，主要把DNA抽提掉，然后按步骤1-4制片观察。方法二材料不经1mol/L HCl水解，直接放在Schiff试剂中染色，然后按步骤3-4制片观察。五、思考题1、Feulgen反应中最关键的步骤是什么？为什么？2、用Schiff试剂对DNA进行染色与染料吸附的方法相比有什么优势？3、为什么Feulgen染色法不对RNA染色？ 实验六 植物染色体标本的制备和观察一、实验目的1、掌握常规压片法制备植物染色体标本的基本原理和方法2、观察有丝分裂过程中染色体的形态特征和动态变化二、实验原理植物染色体标本的制备，常用分生组织，如根尖、茎尖和嫩叶做材料。Belling(1921)提出植物染色体压片技术后，压片已成为植物染色体研究中最广泛应用的常规技术，其程序包括取材、预处理、固定、解离、染色和压片等步骤，是以人工外加机械压力使染色体分散。该方法操作快速简便、省材省时，但是由于植物细胞有坚实的细胞壁，染色体很难像动物染色体那样平整地贴在载玻片上，染色体很难分散开，染色体容易变形和断裂。三、实验用品普通显微镜、剪刀、镊子、刀片、培养皿、滤纸、吸水纸、载玻片、盖玻片、恒温水浴锅、烧杯、洋葱（2n=16）或蚕豆种子（2n=12）、甲醇、冰醋酸、秋水仙素（或对二氯苯）、无水乙醇、1mol/LHCl。改良苯酚品红染色液的配制：母液A：称取3g碱性品红，溶于100ml 70%乙醇中（此液可于4冰箱中长期保存）。母液B：取A液10ml，加入90ml 5%苯酚水溶液（两周内使用）。取B液45ml，加入6ml冰醋酸和6ml 37%甲醛。此为苯酚品红染色液。取苯酚品红染色液10ml，加入90ml45%的醋酸和1.8g山梨醇。放置两周后，染色效果较好。此液称为改良苯酚品红染色液。四、实验内容与方法1、材料培养：把洋葱置于盛有清水的小烧杯口上，使生根部位与水接触，2528条件下培养，根长11.5cm时，于上午9时11时把根尖约0.5cm剪下备用。把干燥的蚕豆种子置水中浸种1天，种子吸水膨胀后转到铺有几层吸水纸的培养皿或瓷盘中，上盖双层湿纱布并加少许水，2528条件下培养，待根长约11.5cm时，于上午911时或下午36时剪下根尖备用。2、预处理：将剪下的根尖置对二氯苯饱和水溶液，或0.1%秋水仙素溶液中，浸泡处理4小时。3、固定：用水洗净处理过的根尖，经甲醇-冰醋酸（31）固定612小时， 再经 95%、85%乙醇各半小时，最后转入70%乙醇中，4保存备用。4、解离：取出根尖，用蒸馏水洗净，放入1mol/LHCl中60解离810min，再用蒸馏水洗2次，每次35min。5、染色：把处理好的根尖放在载玻片上，切取乳白色的分生区，用镊子轻轻捣碎，滴上一滴改良苯酚品红染液，染色 510min后，盖上盖玻片。 6、压片：在盖玻片上面铺上吸水纸，固定好盖玻片，用拇指垂直压片，再用铅笔橡皮头轻敲击，使材料压成均匀的薄层，细胞和染色体分散。图12 洋葱根尖染色体装片 7、镜检：先用中倍镜观察压片中细胞分散状况和中期分裂相的多少，再检查分裂中期细胞中的染色体是否完全分开，然后转用高倍镜寻找分散开的中期染色体，要求数出相应的染色体数。可以看到，染色质和染色体被染成紫红色。如若染色体分散不好而难以分辨和计数，可取下片子，平放桌面上，用手指隔着吸水纸在盖玻片上稍施压力再观察。如果操作细心，用力适度，便可很容易得到染色体分散良好的压片标本。五、思考题1、固定液的作用是什么？在使用固定液时应注意什么？2、预处理中秋水仙素的作用是什么？ 实验七 细胞计数一、实验目的学习、掌握细胞培养中最基本的细胞计数方法。二、实验原理细胞计数法是细胞培养的一项基本技术。它是了解细胞生长状态，绘制生长曲线等的重要手段。在动物细胞原代与传代培养、细胞冷冻与复苏等众多技术中需要进行细胞计数；植物细胞进行悬浮培养也需要测定细胞数目。细胞计数就是从需要计数的细胞悬液中取一定量的细胞进行计数，并通过计数得知原始细胞悬液中的细胞密度以及细胞总数。在细胞计数时，若细胞浓度太高，可进行必要的稀释。常用的细胞计数有电子细胞计数仪计数法和细胞板计数法，但电子计数仪计数法在许多实验室尚未完全推广，细胞板计数法仍是普通实验室目前常用的方法。三、实验用品鸡血红细胞悬液、0.17mol/L NaCl溶液、细吸管、乙醇、细胞计数板、计数器、普通显微镜四、实验内容与方法1、制备鸡血红细胞悬液：取50ml小烧杯1只，以1份鸡血加10份的0.17mol/L NaCl溶液稀释，形成一种不透明的红色液体，此为鸡血红细胞悬液。2、准备计数板：用乙醇清洁计数板及专用盖玻片，然后用绸布轻轻拭干。3、加样：先将特制的盖玻片放在细胞计数板上，使两侧均现带色牛顿环。用细吸管取少量待测细胞悬液，沿盖玻片边缓缓滴入，让其自由渗入，待整个盖玻片下均充满细胞悬液为宜。注意不要使液体流到旁边的凹槽中。4、计数：在显微镜下，用10物镜观察计数板四角大方格（每个大方格又分16个小方格）中的细胞数。计数时，只计数完整的细胞，若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。（如细胞团10%，说明分散不充分；若细胞数200个/10mm2或500个/10mm2时，说明稀释不当，需重制备细胞悬液、计数）在一个方格中，如果有细胞位于线上，一般计上线细胞不计下线细胞，计左线细胞不计右线细胞，计数误差不能超过5%。 图14 细胞计数原则及顺序（计数黑点，不计数白点） 5、计算：将计数结果代入下式，得出细胞密度： 细胞数/ml悬液=（4大方格细胞数之和/4）104五、思考题1、计算细胞密度所用的公式是如何推导出来的？试利用计数板上给出的数据进行推导。2、为什么细胞计数时，细胞悬液逸出凹槽外或有气泡时要重做？ 实验八 植物细胞骨架的光学显微镜观察一、实验目的 掌握用光学显微镜观察植物细胞骨架的原理和方法，观察光学显微镜下植物细胞骨架的网状结构。二、实验原理细胞骨架（cytoskeleton）是由蛋白质丝组成的复杂网状结构，根据其组成成分和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维。它们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化，物质运输，能量转换，信息传递，基因表达的起到重要作用。目前观察细胞骨架的手段主要有电镜、间接免疫荧光技术、酶标和组织化学等。微丝是球形肌动蛋白单体构成的纤维结构，单根微丝直径7nm，在光学显微镜下看不到该细胞骨架的结构，本实验观察的是植物细胞中由微丝平行排列形成的微丝束。常用的观察微丝的方法主要是考马斯亮蓝R-250染色法。当用适当浓度的TritonX-100处理细胞时，可将细胞质膜中和细胞质中的蛋白质和全部脂质被溶解抽提，但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存，经用戊二醛固定，考马斯亮蓝R250染色后，可在光学显微镜下观察到由微丝组成的微丝束为网状结构，这就是细胞骨架。三、实验用品洋葱鳞茎、普通光学显微镜、50ml烧杯、载玻片、盖玻片、刀片、小剪刀、吸水纸、擦镜纸、镊子、滴管1、6mmol/L（pH6.8）磷酸缓冲液（用NaHCO3调pH）：Na2HPO4.12H2O 1.18g；KH2PO4 0.45g溶解于蒸馏水中至1000ml。2、M-缓冲液：用1mol/L HCl调pH至7.2。M缓冲液的配方试剂所需浓度相对分子质量每升加量备注咪唑50mmol/L68.083.40g KCl50mmol/L74.553.73g MgCl2.6H2O0.5mmol/L203.300.10g EGTA（乙二醇四乙酸）1mmol/L380.400.38g EDTA.2H2O0.1mmol/L372.240.04g 巯基乙醇1mmol/L78.1370ld=1.114g/ml，14.3mol/L*甘油（可不加）4.0mol/L92.09294.8mld=12.5g/ml，13.57mol/L3、1%TritonX-100：用M-缓冲液配制。4、3%戊二醛；用6mmol/L磷酸盐缓冲液配制。5、0.2%考马斯亮蓝R250，其溶剂为：甲醇 46.5ml、冰醋酸 7ml、蒸馏水 46.5ml。四、实验内容与方法1、取材：撕取洋葱鳞茎内表皮细胞（约1cm2大小）置于装有6mmol/L磷酸盐缓冲液的烧杯中，使其下沉。2、抽提：吸去磷酸盐缓冲液，用1% TritonX-100处理2030min.。3、冲洗：吸去TritonX-100，用M缓冲液洗3次，每次10min。4、固定：3%戊二醛固定30min。5、冲洗：6mmol/L磷酸盐缓冲液洗3次，每次10min。6、染色：0.2%考马斯亮蓝R-250染色20min。7、制片：用蒸馏水洗1-2次，将标本置于载玻片上，加盖片。8、观察：光镜下可见表皮细胞的轮廓，细胞内存在着染成蓝色、粗细不等的纤维网络结构，即为构成细胞骨架的微丝束。图15 洋葱表皮细胞骨架五、思考题1、戊二醛、考马斯亮兰R250、TritonX-100是什么？在本实验中各起什么作用？ 2、什么是细胞骨架？它有何主要功能？ 3、列举你所知道的动、植物细胞中由微丝组成的结构。 实验九 植物原生质体的分离和活性鉴定一、实验目的1、学习植物细胞原生质体分离纯化的方法。2、了解原生质体活性鉴定的原理。二、实验原理植物原生质体是去除了细胞壁的裸露的细胞。在适宜的培养条件下，分离的原生质体，又可重新合成新的细胞壁，经过细胞分裂并再生成完整的植株。原生质体可从培养的单细胞、愈伤组织和植物器官（叶、下胚轴等）获得。原生质体的分离通常采用酶解法，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶配制而成的溶液能降解细胞壁成分，使原生质体释放出来。原生质体培养的条件和对营养的要求与组织、细胞培养相似。但原生质体由于是除去了细胞壁，其内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜，所以培养基中要有一定浓度的渗透压稳定剂来保持原生质体的稳定，以使原生质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。常用的渗透压稳定剂包括甘露醇、山梨醇、蔗糖等。酶液中还应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。培养基中添加的生长素、细胞分裂素也是必须的。测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双醋酸酯（FDA）染色是常用的一种方法，FDA本身无荧光，无极性，可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后，由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜，因此有活力的细胞能产生荧光，无活力的原生质体不能分解FDA，无荧光产生。高等植物原生质体除了用于细胞融合的研究以外，还能通过它们裸露的质膜摄入外源DNA、细胞器、细菌或病毒颗粒。原生质体的这些特性与植物细胞的全能性结合在一起，已经在遗传工程和体细胞遗传学中开辟了一个理论和应用研究的崭新领域。三、实验用品超净工作台、低速离心机、倒置显微镜、高压灭菌锅、细胞计数板、带盖离心管、细菌过滤器、200目镍丝网、解剖刀、镊子、刻度吸管、培养皿、烧杯、绿豆、70%乙醇、0.1%升汞溶液（加入少许吐温80）、20%蔗糖。1、0.1%2-N-吗啡啉乙磺酸钠（MES）或三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液：内含20%蔗糖，pH6.0。2、酶解液：用0.1%MES或Tris配制1%(WV)纤维素酶，1% (WV)果胶酶，0.7molL甘露醇，10mmol/L CaCl2.2H2O，0.7mmol/L KH2PO4，pH 6.87.0。3、13% CPW洗涤液：用0.1%MES或Tris配制27.2mg/L KH2PO4，101.0mg/L KNO3，1480.0mg/L CaCl2.2H2O，246.0mg/L MgSO4，0.16mg/L KI，0.025mg/L CuSO4.5H2O，13%(W/V)甘露醇，pH 6.0。4、0.02%二乙基荧光素(FDA)：5mg FDA溶于1ml丙酮中，避光4下贮存，使用时取0.22ml FDA贮存液加入5ml 0.65mol/L甘露醇中，使用时使最终浓度为0.01%。四、实验内容和方法1、绿豆种子用70 %乙醇消毒，自来水流水浸泡4 h