有机酸工艺学-2010版.doc

Organic Acids Fermentation Technology, by Huang Guoqing of QAU目录第一章前言1一、微生物工程与发酵工业1二、发酵产品的特点2三、微生物工业的范围2四、微生物工业概况及发展趋势2五、有机酸发酵3第二章柠檬酸3第一节柠檬酸发酵简史3一、世界柠檬酸发酵工业3二、国内柠檬酸产业4三、我国柠檬酸产业面临的主要问题5第二节柠檬酸类物质的性质及用途7一、柠檬酸的结构7二、柠檬酸的物化性质7三、柠檬酸的用途8四、柠檬酸盐9五、柠檬酸酯10六、柠檬酸的生产方法10七、柠檬酸的生产工艺12第三节柠檬酸产生菌13一、黑曲霉13二、酵母15第四节黑曲霉柠檬酸发酵机理16一、柠檬酸的合成途径16二、黑曲霉柠檬酸发酵的代谢调控18三、氧对柠檬酸积累的调节22四、柠檬酸的转运23五、培养条件对柠檬酸积累的影响23六、黑曲霉柠檬酸发酵机制总结26第五节黑曲霉生长和发酵条件26一、黑曲霉的化学组成26二、黑曲霉的酶系27三、黑曲霉生长和发酵的营养条件28四、黑曲霉生长和发酵的促进剂和毒害剂30五、黑曲霉生长和发酵对环境的需求32第六节酵母菌积累柠檬酸的机理33一、概述33二、利用正己烷为原料积累柠檬酸34三、利用葡萄糖为原料积累柠檬酸36第七节发酵原料及其预处理36一、发酵原料36二、原料预处理37第八节菌种扩大培养41一、工艺流程41二、菌种的扩大培养42三、孢子收集与保存43第九节柠檬酸发酵工艺44一、营养要求44二、温度控制45三、pH控制45四、接种量和接种方式46五、溶氧的控制46六、薯干原料的液体深层发酵工艺47第十节柠檬酸表面发酵工艺49一、表面发酵的干孢子接种49二、表面发酵设备50二、培养基制备51三、接种52四、发酵工艺52五、菌膜的处理和利用53第十一节 柠檬酸固体发酵工艺53一、生产工艺53二、主要原料54三、生产菌种55四、固体发酵设备55五、发酵条件和工艺55六、影响固体发酵柠檬酸的因素56七、杂菌的污染与防治56第十二节柠檬酸发酵污染菌及其防治57一、柠檬酸发酵常见的污染菌57二、杂菌污染原因58三、杂菌污染的药物防治58第十三节柠檬酸提取工艺59一、发酵醪预处理59二、发酵液的过滤61三、发酵液的中和62四、酸解63五、柠檬酸溶液的净化65六、浓缩66七、结晶66八、干燥与包装66第十四节柠檬酸工业副产物的利用67一、黑曲霉菌体的利用68二、中和滤液的利用69三、石膏渣的利用69第十五柠檬酸菌种改良70一、菌种改良的总体思路70二、利用准性循环来获得突变株71三、利用基因工程进行菌种改良71第三章乳酸72第一节乳酸发酵简史72第二节乳酸的性质73一、乳酸的结构73二、乳酸和乳酸钙的理化性质73第三节乳酸及乳酸钙的用途73一、乳酸及聚乳酸的用途73二、乳酸钙的用途75三、其他乳酸衍生物的用途75第四节乳酸发酵机理76一、同型乳酸发酵76二、异型乳酸发酵76三、双歧（Bifidus）发酵途径77第五节乳酸生产菌种77一、细菌78二、米根霉（Rhizopus oryzae）79第六节乳酸发酵原料79一、乳酸生产原料79二、乳酸生产的辅助原料81三、原料的预处理82第七节乳酸发酵工艺82一、水解糖发酵工艺82二、淀粉并行发酵工艺83三、根霉发酵工艺83四、细菌乳酸发酵技术要点84第八节产品的提取和精制85一、发酵液的预处理85二、乳酸提取工艺前结晶工艺86三、乳酸钙直接酸解（一步法）工艺88四、乳酸提取新技术89第九节乳酸发酵新工艺90一、固定化细胞和固定化酶技术91二、原位产物分离乳酸发酵91第四章葡萄糖酸及其衍生物93第一节葡萄糖酸的性质及应用93一、葡萄糖酸的理化性质93二、葡萄糖酸及其衍生物的用途93第二节葡萄糖酸发酵机理94一、发酵机理94二、葡萄糖酸发酵微生物95第三节葡萄糖酸发酵工艺96一、黑曲霉葡萄糖酸钠发酵工艺96二、黑曲霉葡萄糖酸钙发酵工艺98三、细菌发酵工艺99第四节产品的提取和精制100一、葡萄糖酸钙结晶100二、葡萄糖酸结晶100三、一水葡萄糖酸结晶101四、葡萄糖酸-内酯结晶101第五章衣康酸102第一节衣康酸发酵简史、理化性质及用途102一、衣康酸发酵简史102二、衣康酸的理化性质及用途103三、衣康酸的用途104第二节衣康酸生物合成机理106第三节衣康酸发酵微生物107一、衣康酸发酵微生物107二、衣康酸发酵菌种的选育108第四节衣康酸发酵工艺109一、蔗糖为原料的衣康酸发酵工艺109二、淀粉为原料的衣康酸发酵工艺111第五节衣康酸提取工艺112一、浓缩结晶法提取工艺112第六章氨基酸发酵谷氨酸114第一节概述114一、氨基酸的生产方法115二、氨基酸的发酵历史115三、氨基酸发酵的发展动向116第二节谷氨酸发酵机制118一、谷氨酸的生物合成途径118二、谷氨酸生物合成的理想途径119三、谷氨酸发酵的代谢途径119四、控制谷氨酸生物合成的重要措施120五、乙醛酸循环的作用120第三节谷氨酸生物合成的调节机制121一、优先合成与反馈调节122二、糖代谢的调节123三、氮代谢的调节124第四节谷氨酸发酵过程中细胞膜渗透性的控制124一、控制磷脂的合成124二、控制细胞壁的合成126第五节谷氨酸产生菌的特征及育种126一、谷氨酸产生菌126二、谷氨酸棒杆菌基因组研究进展126三、现有谷氨酸产生菌的主要特征127四、谷氨酸发酵的代谢控制育种策略128五、利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌129第六节谷氨酸的生产工艺130一、甜菜糖蜜添加吐温发酵工艺130二、甘蔗糖蜜添加青霉素流加糖发酵工艺132第七节发酵条件对谷氨酸发酵的影响133一、发酵培养基对谷氨酸发酵的影响133二、培养条件对谷氨酸发酵的影响135第八节谷氨酸的提取136一、谷氨酸发酵液的性质136二、等电点法提取谷氨酸136三、离子交换法提取谷氨酸137第九节谷氨酸发酵液的综合利用138一、发酵废母液提取菌体蛋白138二、发酵废母液生产饲料酵母139三、废母液回收核糖核酸139四、废母液生产有机复合肥140第十节谷氨酸制味精140一、味精的性质140二、味精的生理作用及安全性140二、谷氨酸制味精的工艺流程141三、谷氨酸的中和与除铁142vii第一章前言一、微生物工程与发酵工业1、微生物工程：微生物工程是将化学工程有关理论和单元操作应用于微生物的工业发酵生产，进而发展起来的具有新的特点的一门学科。2、微生物工程分为两大部分：发酵部分（上游工程）：通过一系列的环节，提供条件，使菌体生长繁殖，并产生发酵所要的目的产物（代谢产物）；提纯部分（下游工程）：通过物理、化学的手段，将代谢产物从发酵醪中提纯出来，获得最终产品。3、微生物工程的历史传统的微生物发酵技术天然发酵：并不知道微生物是如何发酵的，因而很难人为控制发酵过程，生产只能凭经验，口传心授；第一代微生物发酵技术纯培养技术的建立：人为控制发酵过程，再加上简单密封式发酵罐的发明，发酵工业逐渐进入了近代化学工业的行列。该时期的主要产品有酵母、酒精、丙酮、丁醇、有机酸、酶制剂等，主要是一些厌氧发酵和表面发酵产生的初级代谢产物；第二代（近代）微生物发酵技术深层培养技术：1945年抗生素大规模生产。深层培养技术，即机械搅拌式通气技术，推动了抗生素工业以至整个发酵工业的快速发展。第三代微生物发酵技术微生物工程：1972年重组DNA技术导致了多种新型的发酵产品，特别是基因工程的应用。4、微生物代谢产物类型和生产概况初级代谢产物：氨基酸、脂肪酸、核苷酸、维生素、有机酸、乙醇、脂肪等，一般不能过量积累。次级代谢产物：与生产不相伴，生物功能不明确，如抗生素、毒素、胞外多糖等。因外界条件不同而不同。转化产物：底物不是微生物细胞的产物，而是外源物质，微生物仅在其分子上进行加工，如加入羟基、还原双键、脱氧或切断支链等。二、发酵产品的特点1、操作条件比较温和；2、以淀粉、糖蜜等为主，辅以少量有机、无机氮源为原料；3、过程反应以生命体的自动调节方式进行；4、能合成复杂的化合物如酶、光学活性物质等；5、能进行一些殊殊的反应，如官能团导入；6、生产产品的生物体本身也是产物，含有多种物质；7、菌种性能能够改变，从而获得新的反应性能或提高生产率。三、微生物工业的范围1、酿酒工业2、食品工业（酱、醋）3、有机溶剂发酵工业（酒精、丙酮、丁醇）4、有机酸发酵工业（柠檬酸、乳酸、葡萄糖酸）5、酶制剂工业（淀粉酶、蛋白酶）6、氨基酸发酵工业7、核苷酸类物质发酵工业8、抗生素工业9、微生物发酵工业（B族微生素）10、生理活性物质发酵工业（激素等）11、微生物蛋白发酵工业（酵母、SCP）12、微生物环境净化（废水处理）13、生物能工业（沼气、纤维素发酵）14、微生物冶金（探矿、冶金、石油脱硫）：在美国，每年可回收铜720000吨。主要是硫化细菌，产生硫酸将矿物溶解。四、微生物工业概况及发展趋势1、从糖分解产生简单化合物转向复杂物质的生物合成；2、发酵方法代替化学合成方法较多；3、向大型发酵发展（常用20120吨发酵罐）；4、人工诱变育种和代谢控制，新产品、新用途层出不穷；5、开辟新原料五、有机酸发酵有机酸发酵是生物体内的基本代谢过程，是微生物的初级代谢产物，与工业生产和人们的日常生活有着十分密切的关系，有机酸也是发酵工业中历史最悠久、吨位最大、价格最低廉的产品。自19世纪以来，有机酸和溶剂发酵工业受到了来自石油化工的竞争，但是由于它们的原料是可再生的生物资源，加上在微生物育种和生产工艺方面的进步，这些传统的发酵工业仍然具有强大的生命力。在现代有机酸，尤其是食用酸的生产中，发酵法占有很重要的地位。微生物细胞能产生多种有机酸，但是能够进行大规模生产的或者具有商业价值的只有少数，主要包括柠檬酸、葡萄糖酸、衣康酸和乳酸；草酸、富马酸、苹果酸也可用生物合成的方法生产，但由于市场上还存在化学合成产品，因为由生物合成的这类物质需要量较少。目前，产量最高的两种有机酸分别是柠檬酸和葡萄糖酸。根据2005年的数据，2005年全世界的柠檬酸产量达到了近100万吨，其中近50%由中国生产。第二章柠檬酸第一节柠檬酸发酵简史一、世界柠檬酸发酵工业1784年：瑞典化学家Scheel首次从柠檬汁中提出柠檬酸并结晶出固体柠檬酸；1891年：德国微生物学家Wehmer发现一种青霉能产柠檬酸，并开始试生产，但到1903年停止。主要原因是：难以获得适当菌种；菌种易退化；易污染杂菌。到20世纪初，柠檬酸绝大部分都是从柠檬汁中提取出来的，主要产地是意大利的柑橘产业；1913年：Zahorski首先利用黑曲霉生产柠檬酸；但直到此时并未利用微生物开始大量生产柠檬酸；直到第一次世界大战开始后（1914年8月1918年11月），由于意大利的柑橘产业受到了破坏，人们才开始用微生物生产柠檬酸；1916年：美国食品化学家James Currie对黑曲霉属的许多菌株进行普查，发现很多菌种能产生柠檬酸；1919年：比利时一家工厂成功地进行了浅盘发酵法生产柠檬酸；1923年：美国Pfizer公司开始采用黑曲霉浅盘发酵法工业化生产柠檬酸；1952年：美国Miles/Bayer公司首先成功地采用深层发酵法工业化规模生产柠檬酸。由于这种新工业比传统的浅盘工艺有更多的优越性，因而推动了世界柠檬酸发酵工业的迅速发展。1980年左右，世界上最大的柠檬酸企业是Pfizer和Miles/Bayer。1950年到1980年期间，柠檬酸主要用于医药及与健康相关的领域，因此价格一直较高；自1980年起，由于柠檬酸开始广泛的应用于食品领域，柠檬酸的价格开始一路下滑。由于柠檬酸发酵开始广泛使用一些农副产品如玉米浸渍液为原料，许多农产品加工企业开始介入这个领域。比如Archer Daniels Midland（世界上最大的油菜籽、玉米和小麦加工企业）收购了辉瑞的柠檬酸业务、英国的泰莱集团（Tate & Lyle Group，最开始的业务为糖精制）收购了Miles/Bayer的柠檬酸业务，而Cargill（嘉吉公司）则成立了新的柠檬酸生产公司。表1世界主要柠檬酸生产商的生产能力（不含中国）国家公司生产能力（104t/a）备注奥地利Jungbunzlauer16.0新建大型湿磨玉米加工厂德国Bayer约12.0市场采购原料，拟全部出售柠檬酸业务美国ADM12.0拥有大型湿磨玉米加工厂瑞士Hoffmann-La Roche10.0糖蜜原料，浅盘发酵美国Cargill7.25拥有大型湿磨玉米加工厂比利时Citrique Belge6.5糖蜜原料属于Roche二、国内柠檬酸产业1968年：上海酵母厂以淀粉为原料深层发酵工业化产生柠檬酸；同时，适用于多种不同培养基质（淀粉、木薯、糖蜜等）的菌株不断的被选育出来；1995年：开发了利用玉米渣发酵柠檬酸的新工艺；我国柠檬酸发酵技术处于世界领先水平。如安徽丰原生化公司，柠檬酸生产能力达18万吨，居世界第一位，占世界柠檬酸生产额的17%。另外，山东柠檬酸生化有限公司的生产规模也是相当的大。目前，中国有柠檬酸生产厂近百家，总年产能力约100万吨，是全球最大的柠檬酸生产国和出口国，近两年，出口量更是超过国内总产量的90%，出口依赖严重。出口量在全球柠檬酸贸易总量中的比重超过60%。2006年柠檬产量达到66万吨，出口60万吨；2007年，国内柠檬酸及柠檬酸产量76万吨，共出口70.83万吨，2006年和2007年两年国内柠檬酸出口超过总产量的90%，出口依赖严重。全球柠檬酸的年需求量约为130万吨左右，且以年5%-7%的速度递增。2007年，全球柠檬酸需求继续以3%的幅度增长。随着中国人民生活水平的提高，也带动了柠檬酸国内需求的大幅度增加。三、我国柠檬酸产业面临的主要问题1、原料上涨、竞争加剧，柠檬酸出口价格竞争优势弱化由于我国柠檬酸能力急剧增长，国内需求有限，多数柠檬酸都出口到国际市场。而且为争取有限的国际市场，部分企业实行低价竞争，对国际柠檬酸市场形成极大的冲击。虽然我国出口量逐年递增，但出口价格却逐年递减，平均单价由1997年的1062美元/t下降到2000年的837美元/t，2003年下降到历史最低价的650美元/t。我国柠檬酸产品主要以低端产品为主，因此价格要比国际平均价格低93177美元/t。受我国的影响，世界柠檬酸出口平均单价也由2000年的997美元/t，逐年递减到2003年的805美元/t。由于受原料价格上涨的影响，2004年各主要柠檬酸生产商都提高了柠檬酸的价格，世界柠檬酸出口平均价格上涨到811美元/t；2005年世界出口平均价格回升到921美元/t，我国柠檬酸出口平均价格也从2003年的650美元/t回升到2004年的719美元/t，2005年进一步上升到747美元/t。2、企业规模普遍较小，抗风险能力弱国内有近百家柠檬酸企业，产能超过万吨级的仅不到20家。这些小生产企业生产技术落后，环保压力较大，柠檬酸生产过程中会产生大量废液难以治理，环境污染严重，阻碍了该行业的可持续发展。3、产能过剩的风险近年来，由于中国柠檬酸生产能力增长过快，已出现严重供大于求局面，设备利用率不到60%，再加上技术创新滞后及国际市场竞争激烈，导致经济效益呈下滑态势。06年以后，产能过剩现象有所缓和，但是仍然要警惕出现产能建设过快的现象。2007年全世界柠檬酸的产能为150万吨，其中中国的产能为80万吨。4、反倾销调查是中国柠檬酸出口的最大障碍倾销是指在世界市场上以低于正常价值的价格向某一国进行出口。反倾销就是政府采取的为了保护自己的幼稚产业或者主要支柱产业而对外来倾销产品征收反倾销税等措施，通过这些手段使其进口价格与国际市场拉平，以保护自己国内的产业。中国柠檬酸屡遭国外反倾销，导致出口受阻。早在2000年，美国就对中国产柠檬酸进行反倾销调查，中国胜诉；2003年3月，泰国对从中国进口的柠檬酸开始反倾销调查，泰国起诉方指控中国柠檬酸倾销幅度达45%；2003年5月14日，乌克兰对中国生产的柠檬酸进行反倾销调查，并从10月15日起，对中国产柠檬酸征收1305的临时反倾销税，为期4个月。2007年1月19日，南非国际贸易管理委员会在其官方网站发布声明，宣布将对来自中国的柠檬酸产品进行反倾销调查。2007年9月4日，欧委会在欧盟官方公报上宣布，应欧洲化学工业协会7月23日递交的申请，欧委会决定对原产于中国的柠檬酸进行反倾销立案调查。5、人民币持续升值，出口企业损失较大人民币升值影响是影响我国柠檬酸出口的又一大因素，汇率升值造成出口产品的非主动性提价，一定程度上影响柠檬酸的出口量值。以美元为例，初始汇率：1$=8.3rmb(1RMB=0.12$)；升值后：1$=7rmb(1RMB=0.143$)。对于我国出口企业的影响为：升值前国产的柠檬酸出口价格：10$=83rmb(100RMB=12$)；升值后出口价格：10$=70rmb(100RMB=14.3$)。对于进口国家而言，人民币升值带来非主动性价格的提升，因此出口量会受到相关影响，同时对于以外币结算的企业而言，利润空间进一步被压缩。6、产业政策风险加剧限制粮食加工：2007年9月国家发展与改革委员会出台的关于促进玉米深加工业健康发展的指导意见提出，“十一五”期间，玉米深加工结构调整的重点是提高淀粉糖、多元醇等国内供给不足产品的供给，稳定以玉米为原料的普通淀粉生产，控制发展味精等国内供需基本平衡和供大于求的产品，限制发展以玉米为原料的柠檬酸、赖氨酸等供大于求、出口导向性产品，以及以玉米为原料的食用酒精和工业酒精。政策极大限制了柠檬酸行业的未来发展空间。节能减排生产：“十一五”期间，国家将逐步淘汰落后造纸产能650万吨，落后酒精产能160万吨，落后味精产能20万吨，落后柠檬酸产能8万吨；实现减排化学需氧量(COD)124.2万吨。2007年，国家发改委、环保总局下发通知，决定依法对不符合法律法规、产业政策的规定，环保评审不达标、超标或超排污许可证要求排放的落后柠檬酸生产能力实施淘汰。分年度工作任务2006-2009年：分别淘汰落后柠檬酸产能3.3万吨、2万吨、1.9万吨和0.8万吨；减排化学需氧量（COD）3.2万吨。第二节柠檬酸类物质的性质及用途一、柠檬酸的结构柠檬酸（citric acid）又名枸橼酸，学名羟丙基烷三羧酸，分子式如下：异柠檬酸是柠檬酸的同分异构体，它的羟基在2位C上，并且含有2个不对称C原子。柠檬酸是一个叔醇，不易氧化；而异柠檬酸是促醇，容易氧化。异柠檬酸是三羧酸循环中的中间产物。二、柠檬酸的物化性质柠檬酸为无色半透明晶体或白色颗粒或白色结晶性粉末，无臭、味极酸，易溶于水和乙醇，水溶液显酸性。柠檬酸结晶形态因结晶条件不同而不同，商品柠檬酸通常有无水柠檬酸和一水柠檬酸。柠檬酸在水中的溶解度为147g（20），在干燥空气中易风化；柠檬酸易溶于水和乙醇，微溶于乙醚，不溶于苯、甲苯、二硫化碳、四氯化碳和脂肪酸中。柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离。加热易分解产生多种产物。由于柠檬酸含有羟基和羧基，因此既可以同酸发生反应，又可以同碱发生反应，还可以与醇类发生酯化应。比如：柠檬酸与发烟硫酸混合，常温下即可脱水生成乌头酸，与硝酸作用可生成硝酸酯；柠檬酸可与各种碱发生中和反应生成各种盐；柠檬酸与甘油混合共热可得到柠檬酸甘油酯；由于含有OH，可被各种氧化剂，如KMnO4氧化。三、柠檬酸的用途由于柠檬酸的酸性、风味及与金属离子形成复合物的能力，在工业中有广泛的用途。据统计，目前75%的柠檬酸用于食品及饮料工业，10%用于制药行业，15%用于其它行业。1、在食品工业中的应用柠檬酸被称为第一食用酸味剂，在食品工业上极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂、螯合剂等。酸味剂：柠檬酸作为酸味剂具有酸味圆润滋美的特点，广泛用于汽水、果汁、果冻、水果罐头等生产加工中。通常使用量为0.1%0.5%，具体使用量可视品种和需要而定。如在清凉饮料中用量为0.13%0.3%，具体参考用量为：碳酸水中0.3%，汽水中0.2%，乳酸菌饮料中0.15%，在果汁、果冻、果酱、糖果中的用量约为1%。柠檬酸可感觉酸味的最低浓度为0.0025%0.08%。在某些果蔬制品中还可以通过柠檬酸和糖来调节制品的糖酸比。如柠檬酸在罐头、果酱、果冻等制品中，可使pH值降低，抑制腐败微生物的繁殖。一般当pH值小于5.5时，大部分腐败细菌可被抑制。同时通过柠檬酸调整pH值还可改善产品品质和风味。蔗糖转化剂：在蔗糖液中添加适量柠檬酸可使其转化为转化糖，可提高蔗糖的饱和度和粘度，增大渗透压。因此用于果酱、果冻中有改善风味、防腐和促进蔗糖转化的作用，防止蔗糖晶析而发砂，改善产品质地。稳定色素：果蔬原料放在1%2%的食盐和0.1%的柠檬酸混合液中浸渍，可抑制果蔬原料酶褐变引起的变色。同时由于柠檬酸的高酸性，它还具有良好的防腐功能，能抑制细菌增殖，且能增强抗氧化剂的作用。如切去皮后的果蔬原料在0.1%的抗坏血酸溶液中浸渍后可防止氧化褐变。在使用时一般以柠檬酸作增效剂，以控制多酚氧化酶的活力，防止酶褐变。面制品改良剂：在面食制品中用小苏打疏松剂时，制品往往碱度增大，口味变劣。若柠檬酸和小苏打同时使用，可使小苏打分子在反应过程中产生的二氧化碳被吸收，不致使碳酸钠积累，从而降低面制品的碱度，改善口味。抗氧化剂：由于柠檬酸可以和金属离子形成复合物，因此可用于油脂的抗氧化，比如可与铁离子螯合而终止由铁离子引起的脂质氧化过程。此外，柠檬酸还可作为冷冻水果和水果加工品中维生素的稳定剂，以及作为软饮料、冷饮、糖果、焙烤食品、胶姆糖的增香剂。2、在药物中的应用泡腾剂：腾片是近年来国外开发应用的一种新颖片剂。它与普通片剂的不同之处，就在于它还含有泡腾崩解剂，当泡腾片放入饮水中之后，在泡腾崩解剂的作用下，即刻产生大量气泡（二氧化碳），使片剂迅速崩解和融化，有时崩解产生的气泡还会使药片在水中上下翻滚，加速其崩解和融化。片剂崩解时产生的二氧化碳部分溶解于饮水中，使饮水喝入口中时有汽水般的美感。该释放体系即是由柠檬酸与碳酸钠或碳酸氢钠组成。还广泛的用于各种营养口服液，用于调节产品的pH。抗凝剂：在医药工业中用作抗血凝剂（临床上采取新鲜血液时，需要加入一些消毒过的柠檬酸钠或草酸钠，就能起到防止血液凝固的作用，所以柠檬酸钠和草酸钠被称为抗凝血剂）、化痰药和利尿药。抗氧化剂：可以防止维生素氧化。3、在工业上的应用金属净化：柠檬酸是一种弱有机酸，但又具有螯合作用，它可引起金属表面层的轻微的损害，然而作为金属离子螯合剂则又可以加速金属氧化物的迁移。现在多采用柠檬酸来取代无机强酸用于金属表面氧化物的清除。去垢剂：柠檬酸能增加去污性能，可作为磷酸盐（三聚磷酸钠）的代用品，大量应用于洗衣粉和去污剂之中。三聚磷酸钠作为助洗剂在洗涤剂中的大量应用是合成洗涤剂工业的一个重要发现。但是，磷酸盐随着洗涤污水排入江河湖泊，造成水质富营养化，促进了水藻类快速繁殖，水中缺氧，危害水生动物的生存，因而成为环保的一大问题。电镀：柠檬酸盐是最常用的电镀缓冲剂和络合剂。其螯合作用使电镀操作稳定，产品质量好。四、柠檬酸盐1、柠檬酸钙在柠檬酸的工业化生产中，一般是先制成柠檬酸钙沉淀，然后再用硫酸溶解得到柠檬酸。柠檬酸钙盐有三种类型：柠檬酸一钙、柠檬酸二钙和柠檬酸三钙，工业生产中的柠檬酸钙系指柠檬酸三钙，为白色晶体或粉末。在食品工业中用作鳌和剂、缓冲剂、组织凝固剂以及钙质强化剂。2、柠檬酸钠抗凝血剂，它能螯合凝血所需要的Ca2+离子，广泛用于输血、血液和血浆保存以及人造代血浆；用于食品中作为风味剂和pH缓冲剂；磷酸盐（三聚磷酸钠）的代用品。3、柠檬酸钾柠檬酸钾在体内代谢生成醋酸钾，自肾脏而排出体外，从而可以增加血液和尿的碱度，用于治疗膀胱炎和糖尿病所导致的酸中毒，它也是一种补钾剂。4、柠檬酸锰缺锰病人的营养剂和收敛剂。5、柠檬酸铜工业分析用试剂，医药上用作消毒杀菌剂兼有收敛作用，用于配制眼药膏治疗结膜炎、沙眼等。五、柠檬酸酯柠檬酸衍生物包括酯类、酰胺类和酸酐，以及分解产物等，它们也是在工业上有重要用途的一大类化合物。1、柠檬酸三甲酯和柠檬酸三乙酯柠檬酸三甲酯是柠檬酸和甲醇酯化而成，无色结晶，易溶于醚和醇，微溶于水。是一种化工原料，比如可做彩焰蜡烛的主燃剂，它的熔点和可燃性能完全满足蜡烛制品的要求；还用于医药和农药合成方面，它是一种性能稳定的中间体；还是柠嗪酸生产的主要原料。柠檬酸三乙酯由柠檬酸和乙醇酯化而成，无色透明液体，微具气味，可作为纤维素树脂和乙烯基树脂的增塑剂，且具有抗霉特性。2、柠檬酸和脂肪酸甘油酯由柠檬酸酐与单双甘油酯反应生成。为白色至黄色蜡状固体或质软半固体。有香气，味温和，不溶于冷水，能分散于热水，易溶于乙醇，用作乳化剂和金属螯合剂，在人造奶油中用量为10g/kg。六、柠檬酸的生产方法1、从柠檬汁中提取1826年英国的John和Edmund Sturge开始从意大利柠檬汁中提取柠檬酸进行商业化生产。但是由于柠檬酸在商业中极其重要的地位，意大利的柠檬种植商开始自行生产柠檬酸，并很快垄断了柠檬酸的生产。1919年以前，柠檬酸均是从柠檬汁中提取得到。但1919年时，比利时的科学家发明了利用黑曲霉发酵工业化生产柠檬酸的方法，此时柠檬酸的生产方式才发生了重大变化。在此期间，全球的柠檬酸市场受到欧洲及美国相关政策的调控。在欧洲，当时将柠檬加工成柠檬汁是有加工补贴的，因此许多柠檬种植商都倾向于加工柠檬而不愿意出售鲜果；另外，在此期间欧盟的干预机制还导致大量柠檬树被毁坏。在美国，柠檬酸的生产和销售由一个专门的部分还管理（United States Department of Agriculture (USDA) Lemon Administrative Committee），该机构决定了每年有多少柠檬以鲜果的形式出售，以及哪些种植区域可以销售柠檬。垄断最终的结果就是导致产品价格昂贵，柠檬酸工业也不例外。意大利对柠檬酸工业的垄断及柠檬酸应用范围的日益广泛，使得人们开始寻找柠檬酸来源的替代品（即其它植物），但均以失败而告终。随着19世纪化学及微生物学的发展，人们开始将目光转向化学法和生物法。2、化学合成法1880年有人提出了利用甘油或二氯丙酮来合成柠檬酸的工艺：除了上述方法外，还有人开发出了利用其它物质作为起始原料的工艺，但结果表明，所有的化学法在经济方面都缺乏竞争力，要么是起始原料的成本比产品还要贵，要么是太多步骤导致的低得率，要么是在化学合成中需要用到危险化学品。3、微生物发酵法Wehmer于1893年发现，青霉菌能够在含糖和无机盐的培养基中积累柠檬酸。该项研究当时并未直接导致柠檬酸的生物法生产工艺，但是却促进了人们对生物发酵工艺的兴趣和研究。随后人们又相继发现了多种微生物可以富集柠檬酸，如Aspergillus niger, A. awamori, A. fonsecaeus, A. luchensis, A. phoenicus, A. wentii, A. saitoi, A. lanosius, A. flavus, Absidia sp., Acremonium sp., Aschochyta sp., Botrytis sp., Eupenicillium sp., Mucor piriformis, Penicillium janthinellum, P. restrictum,Talaromyces sp., Trichoderma viride和Ustulina vulgaris等。Currie于1917年发现A. niger的一些菌株在低pH、高糖浓度及高矿物盐含量的培养基中能积累柠檬酸。随后Currie就加了入了Chas. Pfizer & Co. Inc，该公司于1923年便在美国成立了柠檬酸发酵工艺。Currie的发现为柠檬酸的发酵法生产工艺奠定了基础。当工厂及在比利时和英国等国的工艺采用的均是发表发酵工艺。七、柠檬酸的生产工艺1、表面培养工艺（surface method）柠檬酸最开始的工艺为表面培养工艺，即：在很多狭长的、由高纯铝或不锈钢制成的托盘中（容积为50至100升）放入液体培养基，其深度约为5至20cm，表面积约为5m2。然后将菌种接种至培养基中，菌丝体便开始在培养基表面生产并产酸。在实际生产中，通常是多个托盘堆放在架子上，以便于在无菌条件下操作。最开始时使用的碳源有多种，随着工艺的发展，甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜逐渐成了主要的碳源。表面培养工艺的培养时间一般为8至15天。表面培养工艺在最开始的一段时间内在经济上是可行的，但该工艺工作量大，而且空间利用率不高，因此在20世纪40年代起人们开始考虑其它的生产工艺。2、深层培养工艺（submerged process）由于深层培养工艺劳动量小、生产率高，且占地面积小，逐渐成为了工业国家柠檬酸的首选工艺。3、连续和固定化工艺（continuous and immobilized process）1979年有人报道了柠檬酸的连续生产工艺，该工艺的生产效率更高，但是目前还没有工业化应用的报导。该工艺并不将碳源用做限制性底物，因此过量的碳源会流出反应器。由于碳源是柠檬酸生产工艺中的主要成本因素，因此就这点而言连续工艺并不如分批发酵工艺。虽然可以通过添加多个连续的反应器来克服这个问题，但是这也抵消了连续发酵其自身的优点。还有人报道了利用固定化菌丝体进行柠檬酸发酵的报导。虽然可以利用海藻酸钠或者是胶原蛋白将菌丝体包埋起来，但是柠檬酸发酵的产率很低。这是由于固定化降低了氧气的扩散，从而限制了菌丝体的生产和柠檬酸的积累。4、酒曲工艺（koji process）该工艺类似于固体发酵工艺，起源于日本，主要采用当时易获得的麸皮和水果废弃物作为碳源。目前该工艺主要存在于东南亚国家，并且生产规模均较小。由于微量元素及其它工艺参数难以控制，因此该工艺的放率较低。第三节柠檬酸产生菌柠檬酸是好氧（或兼性好氧）生物体内代谢枢纽三羧酸循环的成员之一，在这些生物体中自然是广泛存在。微生物中能向体外分泌和在环境中累积柠檬酸的也很多，但在工业生产上有价值的只有几种曲霉和几种酵母，其中黑曲霉是现在工业上最有竞争力的菌种。一、黑曲霉1、形态特征在察氏琼脂上长成局限菌落，室温下培养10-14天直径可达2.5-3cm，由致密或中度疏松的白色或微黄色菌丝组成，菌丝大部分在培养基内，有着生长密集的直立孢子梗。典型菌落为碳黑色，但有时也为深褐黑色；反面通常无光，偶尔中心甚至全部呈淡黄色。有霉味，不典型；无分泌物，或局限为微小液滴，无色。分生孢子：成熟时典型的形状为球形，偶尔稍扁，不同菌株中大小稍有不同，直径为4-5微米，呈褐色；壁较厚，不规则粗糙，或显示低度或中度毛刺，一般不连续，使表面看上去似乎排列着明显的色条。黑曲霉中麦芽汁琼脂培养基上菌落生长较快，室温下2周可达5-6厘米，平坦，少数菌株稍有絮毛状物，孢子密集遍布，碳黑色或很黑的黑褐色；反面无光或微黄。无分泌物，稍有气味，不典型。分生孢子头和察氏琼脂培养基上很相似，但典型地着生在较短的分生孢子梗上，成熟时分裂成柱状物的倾向更大。其它特征与上述相同。2、生活周期黑曲霉属半知纲菌，一般只进行无性繁殖。由孢子发芽到孢子形成成熟为一个生活周期。孢子在培养基中4-6小时开始发芽，长出1-2根菌丝，菌丝不久即出现分支。黑曲霉菌丝是多细胞结构，有横隔，其中可育细胞称为足细胞，由足细胞长出分生孢子梗。分生孢子梗顶端膨大成顶囊，上面遍生二层小梗，小梗上生成成链的孢子。这样一个生活周期大约为60小时。但黑曲霉菌丝是不断生长延长的，孢子也逐渐不断地产生，直到营养枯竭为止。3、黑曲霉的分离黑曲霉生命力强，具有分解淀粉、蛋白质、脂肪、果胶等多种物质的活性强大的酶系，在自然界分布极广。它易于从土壤和腐烂的植物材料中分离出来，一般可以用酸性土壤作为分离源。考虑到柠檬酸生产菌应该具有产酸能力强和耐柠檬酸浓度高的特性，可以采用下述方法分离：（1）酸性滤纸法用薯干粉10克、柠檬酸15克和土壤水稀释浸出液100mL混合，点布到培养皿中的数层滤纸上，在30培养，待长出黑褐色具有黑曲霉特征的菌落挑到斜面上。这种分离方法主要是根据黑曲霉耐柠檬酸的能力设计的。如果生长良好，说明黑曲霉在高浓度柠檬酸环境下各种酶系仍能发挥作用，这是柠檬酸发酵所希望的性质。这种方法主要用于从混杂分离源中分离黑曲霉，它完全避免了其它杂菌的干扰。实践证明，这样分离出来的几乎全是产柠檬酸的黑曲霉。（2）指示剂法又称变色圈法。平板采用察氏多民琼脂培养基加入0.04%溴甲酚绿：蔗糖30g、NaNO3 2g、MgSO47H2O 0.5g、KH2PO4 1g、KCl 0.5g、FeSO47H2O 0.01g、溴甲酚绿0.4g、琼脂20g、蒸馏水1000mL。土壤浸出液经稀释后，涂在上述培养基制成的平板上，于30发酵。由于产酸，菌落周期会出现黄色变色圈。在黄色变色圈还末互相相连成一片时，测量变色圈与菌落直径之比。取这个比例较大者，并且具有黑曲霉特征的菌落挑出。这种方法也适合于诱变以后的分离。4、黑曲霉的初筛用酸性滤纸法从土壤中分离出来的黑曲霉只能说明耐柠檬酸浓度很高，用变色圈法分离出来的也只能是在平皿上产酸（不一定是柠檬酸）能力较强者，它们都必须经过初筛以确定在相应条件下的柠檬酸产生能力。初筛方法是根据研究者对面种的要求而设计的，例如要求菌种耐高温、抗杂菌污染等，更首先要考虑的是菌种所要适应的原料。常用的柠檬酸发酵碳源是薯干粉、马铃薯粉、水解糖、糖蜜和石油等。众所周知，柠檬酸积累是在黑曲霉代谢失调的情况下发生的。对于野生菌株，只有用控制环境因子的办法来使其代谢失调。控制的方法可以用下述一种或数种方法：限制磷酸盐含量在亚适量水平；限制铁含量在亚适量水平；锰控制在缺乏水平；铜要高达与铁拮抗的水平；加入毒性化合物，如甲醇、季胺化合物、萘酚等。对于野生菌株，控制上述因素是必要的，否则难以积累柠檬酸。对于诱变后的突变株可以不必如此，因为可以利用菌株的变异来获得代谢失调而积累柠檬酸的能力。5、黑曲霉柠檬酸高产菌的生理特征能耐高浓度的柠檬酸（15%以上），但不能利用和分解柠檬酸；耐高浓度葡萄糖，能产生和分泌大量的酸性-淀粉酶和酸性糖化酶。其-淀粉酶在pH2.0仍能保持原活力的80%以上，在pH2.5、40下作用30min尚不失活；其糖化酶最适作用pH在4.0-4.6，最适温度为6065。在柠檬酸发酵条件下，当培养pH下降至2.0以下时，仍能保持大部分活力；能抗微量金属离子，尤其能抗较高浓度的Mn2+、Zn2+和Cu2+；在液体深层发酵培养时，能形成大量的细小菌球体，菌球体直径0.1mm，菌球量达104个/mL以上。在以葡萄糖为唯一碳源的合成培养基上生长不好，生成小菌落，孢子形成能力弱；在生长、繁殖期，细胞内具有较高水平的氨基酸、NH4+，即NH4+库水平高；菌丝体中含有低水平的甘油三酯和磷酸酯；在生长期和产酸期，细胞内蛋白质核酸水平低；具有很强的侧系呼吸链活性，此侧系呼吸链不产ATP。二、酵母直到本世纪70年代，黑曲霉几乎是柠檬酸发酵的唯一菌种。但酵母的柠檬酸发酵研究从60年代开始逐渐活跃起来。酵母的重要性在于它们的烷烃发酵柠檬酸能力远强于黑曲霉，对烷烃转化率可达56%，所得柠檬酸产率最高达可14.3mg/mL。但缺点是酵母发酵液中其它有机酸的含量较高。就目前而言利用正烷烃作为碳源来发酵生产柠檬酸是不划算的，但在1970年的时候在意大利还是建立了一个工厂。当时的反应容器为400立方米，发酵周期为72小时。发酵完成后，离心除去菌体，再按常规的手段进行柠檬酸的分离纯化。由于烷烃溶解性较差，在发酵之间必须在溶液中完全分散，因此通常还需要在培养基中加入一定量的乳化剂。用酵母生产柠檬酸主要的有如下菌种：1、解脂假丝酶母（Candida lipolytica）解脂假丝酵母一般都是从含有动植物油或矿物油的材料中分离出来的。它不能发酵任何糖类，能同化的糖和醇类也很少，但分解脂肪的能力很强。在柠檬酸发酵中，较好的碳源是正烷烃。酵母发酵的pH值较高（pH5.0以上），另外正烷烃的分解需要硫胺素、核黄素等维生素。烷烃酵母发酵生产柠檬酸的一大缺点是发酵液中大量积累异柠檬酸。在无控制措施的情况下，异柠檬酸可达生成总酸的50%以上。采用诱变改造方法，可以使突变菌株的乌头酸水合酶活性降低，从而使产物中的异柠檬酸大大减少。2、季也假丝酵母（Pichia guilliermondii）该酵母可以由烷烃发酵生成柠檬酸，也可以由糖类（葡萄糖、蔗糖等）发酵生成柠檬酸。发酵的最适pH为3.54.0，略低于解脂假丝酵母。适宜发酵温度2630，可以利用硫酸铵、氯化铵、硝酸氨和尿素等碳源。第四节黑曲霉柠檬酸发酵机理自20世纪30年代起黑曲霉积累柠檬酸的机理就引起了人们的广泛关注，因为只有对工艺有深入的了解才能以工艺条件进行优化，进而提高柠檬酸的产率。当时提出了很多种理论来解释柠檬酸的积累机制，而这些解释实际上也反映出了当时科技的进步。虽然目前对柠檬酸积累机理的研究已经有数十年的历史，但仍有很多问题仍没有弄清楚，目前还没有一种理论能够解释柠檬酸发酵工艺中所有的现象。一、柠檬酸的合成途径目前柠檬酸主要是采用黑曲霉发酵生产，因此以黑曲霉中柠檬酸的合成途径为例进行介绍。早在1954年，Cleland和Johnson就发现，柠檬酸的积累主要是通过糖酵解途径来实现的。目前，对黑曲霉中的柠檬酸合成途径普遍认为是：葡萄糖经EMP、HMP途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA，另一方面经CO2固定反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸。黑曲霉可以由糖类、乙醇和醋酸等发酵产生柠檬酸这是一个非常复杂的生理生化过程。现在普遍认为柠檬酸是经过EMP途径、丙酮酸羧化和三羧酸循环形成的。1、EMP途径的证实由Kubicek和Rohr于1981年通过测定关键酶和放射性呼吸测定法证实。黑曲霉柠檬酸产生菌在生长期，葡萄糖的降解是由酵解和戊糖磷酸途径共同完成的，其比例为EMP/HMP=2:1；在柠檬酸产酸期，也存在HMP途径的酶，其比率为EMP/HMP4:1，即80%的葡萄糖由EMP途径代谢。HMP途径主要存在于孢子形成阶段，因为它提供合成核酸所需要的前体物质。因此EMP途径在黑曲霉柠檬酸生产菌中起主要作用。事实上，EMP途径存在于微生物所有的主要类群中。HMP途径存在于大多数好氧菌和兼性厌氧微生物中。该途径的主要生理意义是为细胞产生还原力（NADPH）、结构分子的来源（如核糖和芳香族氨基酸前体）等。在柠檬酸发酵中，HMP途径只占碳代谢的很少一部分。随着培养时间的延长，HMP途径所占的比例会越来越低。2、三羧酸循环和乙醛酸循环的证实Ramakishman和Martin等在19541955年间的研究发现黑曲霉中存在三羧酸循环的酶系，证实黑曲霉中存在TCA循环。Olsen于1954年证明黑曲霉中存在异柠檬酸裂解酶，此酶将异柠檬酸裂解为乙醛酸和琥珀酸。Kornberg于1958年证明发现生长在醋酸和异柠檬酸上的黑曲霉，生成了标记的苹果酸，有力地证明了黑曲霉中存在乙醛酸循环。由此可见，黑曲霉柠檬酸生产中存在TCA循环和乙醛酸循环。在以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱。在三羧酸循环的中途，形成异柠檬酸后在异柠檬酸裂合酶的催化作用下分解为琥珀酸和乙醛酸，乙醛酸又可通过苹果酸合成酶的催化与乙酰辅酶A结合生成苹果酸的代谢。乙醛酸循环途径在许多微生物和植物细胞中都存在，它可以对三羧酸循环的顺利进行起协助作用，提供较多的C4物以保证C2物的氧化。3、丙酮酸演化途径的证实在积累柠檬酸的情况下，三羧酸循环已被阻断，显然必须要有另外的途径提供草酰乙酸。通过连续测定柠檬酸发酵过程中气体代谢表明，在主发酵阶段，柠檬酸生成的速度与CO2固定量有化学计算的比较关系，证明了CO2固定反应对柠檬酸积累具有重要的生理学意义。研究发现，黑曲霉有两个CO2固定系统，这两个系统都需要Mg2+和K+，其一是丙酮酸在丙酮酸羧化酶作用下生成草酰乙酸，此酶的反应为：其二是磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）在PEP羧化酶的作用下羧化生成草酰乙酸：前一个酶的平衡常数为0.818，而后者仅为0.049，因此黑曲霉柠檬酸产生菌中CO2固定主要是通过丙酮酸羧化酶催化的。在黑曲霉中不存在苹果酸酶，不可能催化丙酮酸还原羧化生成苹果酸。苹果酸酶催化如下反应：其作用是供给三羧酸循环中间体的补充反应。因此，黑曲霉中的柠檬酸合成途径如下图所示：二、黑曲霉柠檬酸发酵的代谢调控柠檬酸是中枢代谢途径TCA循环一员，是许多组织和微生物中广泛存在的一种重要有机酸，它不仅为许多微生物同化利用，而且是