Smad5基因在小鼠耳蜗胚胎发育中的作用.doc

Smad5基因在小鼠耳蜗胚胎发育中的作用【摘要】目的检测Smad5基因在小鼠耳蜗胚胎发育中的作用。方法选用耳廓反应灵敏、健康的C57BL/6小鼠作为种鼠交配，用观察阴栓方法获得胚胎9天到20天的胎鼠，17天取胚胎头，18天在显微镜下取耳蜗，胚胎头水平冰冻切片，耳蜗平行于蜗轴冰冻切片，HE染色方法观察小鼠内耳发育形态演变过程，免疫组织化学方法检测Smad5蛋白在小鼠胚胎1020天的表达情况。结果胚胎10天，听泡发育，胚胎12天听泡下部有蜗管始基形成并开始发育。胚胎18天，蜗管发育了2圈，形成了可以辨认的内、外毛细胞，血管纹开始分化。Smad5在小鼠内耳胚胎发育全程均有阳性表达，且表达比较广泛，尤其早期在整个听囊均有表达。在胚胎1517天，主要集中在即将发育成基底膜听觉感受器的部分。在胚胎发育中后期在内外毛细胞、螺旋神经节细胞、支持细胞、血管纹、基底膜、前庭膜等也有表达。结论Smad5参与小鼠耳蜗胚胎发育全过程，它可能为听觉的发生所必需的基因。 【关键词】 Smad5基因；内耳；发育；耳蜗；C57小鼠；免疫组化Role of Smad5 in the embryonic development of the mouse cochlea YU Ya-ping， YANG Shi-ming， HU Yin-yan， GUO Wei， SUN Jian-he， YU Ning HAN Dong-yi， YANG Wei-yan Department of Otolaryngology and Head Neck Surgery, Institute of Otolaryngology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853，China 【Abstract】To explore the role of Smad5 in the development process of the embryonic mouse cochlea. Methods Embryos were isolated from timed-pregnant C57BL/6 mice（1 dpc=Vaginal plug）. Frozen sections from embryos were processed for HE staining to observe the morphological change of embryonic mouse cochlea and for immunohistochemistry to determine the expression of Smad5. ResultsAt the tenth day of gestation the otocyst was a closed ovoid sac. The cochlear duct started to develop at the twelfth day of gestation as an extension of the ventral part of the otocyst. At the eighteenth day the inner and outer hair cells were identified. Smad5 gene was expressed extensively in the cochlea throughout the whole gestation. From the fifteenth to seventeenth day Smad5 expression was concentrated in the part to be going to develop into auditory receptor organ on the basal membrane. Later, Smad5 was expressed in the supporting cells, hair cells, spiral ganglion, Reissner’s membrane and epithelium of stria vascularis. ConclusionThe Smad5 exists in the mouse cochlea throughout the whole gastation and might play an important role in the development of mouse inner ear. 【Key word】Smad5;Inner ear;Development;Cochlea;C57 mouse；Immunohistochemistry Smad5是新近发现的参与转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号下游的细胞质内信号转导分子，属于受体激活型Smads,它主要介导BMP的信号。先前的研究发现，TGF-β超家族中的骨形态形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）在脊椎动物的内耳形成中起着至关重要的作用12。Smad5基因敲除导致小鼠中、重度听力下降，耳蜗基底膜毛细胞缺失，以外毛细胞为主，Smad5基因可能是听功能相关基因3。以往的原位杂交和免疫组化研究显示，Smad5基因在成年小鼠耳蜗中有高表达，表达部位在毛细胞、螺旋神经节细胞、支持细胞、血管纹和基底膜等4。但是Smad5基因在耳蜗发育过程中什么时间开始表达，在什么部位表达则尚未见报道。本研究用免疫组化法检测了Smad5在耳蜗胚胎发育中的表达情况及表达部位，探讨Smad5在听觉胚胎发育过程中的作用。 1材料和方法 挑选耳廓反应灵敏、健康的2月龄C57BL/6小鼠（北京大学医学部实验动物中心提供）以公：母=1： 2的比例共40只作为种鼠，下午5点左右合笼，次日晨8点观察母鼠阴道，若有阴栓，记为胚胎第一天（E1）。 1.1标本处理 按规定日期，断头剖腹取孕第9天到第20天胚胎（其中≤17天取胚胎头，≥18天在显微镜下快速取耳蜗）。标本浸泡固定于4% 多聚甲醛 + 2.5% 戊二醛中4 24h以上。10 EDTA脱钙48小时后放入20的蔗糖溶液中过夜。OCT包埋作冰冻切片，胎头平行切片，耳蜗平行于蜗轴连续切片，片厚6 ?滋M。连续切片，行常规HE染色，光镜下观察内耳形态学演变过程。间断取片-70 冰箱保存用于免疫组化。 1.2Smad5基因表达检测 1.2.1一抗羊来源mad5抗体，美国Santa Cruz生物技术公司生产，稀释度为1：100。 1.2.2SP检测试剂盒，内配生物素化兔抗山羊抗体(2抗)，辣根酶标记链霉卵白素，正常封闭羊血清。 1抗、SP检测试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司。 1.2.3染色方法及步骤 取冰冻切片，60 烤片半小时。PBS浸泡5分钟。3% H2O2去离子水孵育10分钟；正常兔血清封闭液室温孵育15分钟，倾去，不洗；滴加1：100一抗，湿盒内37 孵育3小时；PBS冲洗，3分钟 × 3次；滴加二抗工作液，室温孵育15分钟；PBS冲洗，3分钟 × 3次；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育15分钟；PBS冲洗，3分钟 × 3次。DAB显色，洗涤，终止显色。脱水，透明，予中性树脂封片。阴性对照用PBS代替一抗。光学显微镜下观察结果。 2结果 小鼠耳蜗发育形态演变参见本期小鼠耳蜗胚胎发育过程中Smad4基因的表达，胚胎10天耳基板内陷形成椭圆形的听囊。图1示 12天的胚胎小鼠，图中小鼠胚胎头部横线示切片方向。Smad5在胚胎10 12天时整个听囊均有表达（图2、3）。Smad5在胚胎13天发育的半圈蜗转中有微弱的表达，在胚胎14天的蜗转中Smad5有明显表达（图4）。在胚胎15 17天，Smad5主要表达在即将发育成基底膜听觉感受器的部分，在此过程中毛细胞分化初具形态，血管纹、螺旋缘尚未分化（图5）。在内耳发育的中后期，Smad5在整个耳蜗均有很强的表达，主要表达在内外毛细胞、螺旋神经节细胞、支持细胞、血管纹、基底膜、前庭膜等（图6）。阴性对照未见染色（图）。 3讨论 脊椎动物的内耳起源于胚胎外胚层，从菱脑头端两侧的表面形成听板开始，在相关基因调控及邻近中胚层诱导下发育为听凹、听泡，同时感觉前体细胞形成，并进一步开始增殖分化，逐渐形成感觉细胞5-6。内耳发育过程受多种基因精细、准确地调控，这些基因通过编码转录因子、生长因子、分泌因子或受体蛋白等重要的生物分子，以不同的机制对内耳发育起重要作用。Smad5是Smad蛋白家族中的成员,主要介导骨形态形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）的信号。BMP通过调节一群广泛多样的基因活性，控制着如中胚层形成、左右对称、神经系统发生、体节和骨骼发育等基本的发育过程78。Smad4可分为三类:受体激活的Smads，包括Smad1, 2, 3, 5, 8，与1型受体直接作用并被磷酸化后，与通用Smad，即Smad4形成复合物移至核内，作为转录因子直接与DNA结合，或与其它转录因子、辅助活化/抑制因子相互作用，调节靶基因对TGF-p信号的应答。此外为抑制型Smads，为Smad6， 7。最初的体外实验表明， Smad2和Smad3在TGF-β、 Activin下游起作用，而Smad 1和Smad5对BMP信号发生反应9-15。先前的研究表明Smad5基因剔除小鼠在胚胎11.5天前死于多种胚胎及胚外组织缺陷16。 Chang等用原位杂交技术检测到Smad5在鸡的胚胎时期的耳囊中有表达17。本研究中用免疫组化技术显示Smad5在耳蜗发育最初的听囊即开始表达，且在胚胎耳蜗全程中表达，胚胎发育后期在已发育的内外毛细胞、支持细胞、血管纹、基底膜等有很强的表达。这与郭维等用RT-PCR、免疫组化技术检测到的结果基本一致——Smad5在成年小鼠整个耳蜗均有很强的表达，主要表达在内外毛细胞、螺旋神经节细胞、支持细胞、血管纹、基底膜等4。虽然郭维等用的是昆明白小鼠，我们实验选用C57小鼠，但是从表达情况看，此两种品系的小鼠并没有太大的差别。说明Smad5在哺乳动物小鼠耳蜗发育中起作用，而且从耳囊开始发育到成熟耳蜗均表达，提示Smad5可能是维持耳蜗正常功能的基因之一。 影响内耳发育的分子生物学因素是是一个极其复杂的网络，它们的确切机制尚不清楚。目前对TGFβ家族在内耳中作用的研究主要集中在BMPs在耳蜗形成中的作用，而其下游信号的调控因子——Smad5在耳蜗中的具体作用还少有报导。本实验研究了C57BL/6小鼠内耳发育形态学特点，并首次检测了Smad5在C57BL/6小鼠胚胎1020天耳蜗中的表达情况，研究了其在小鼠耳蜗发育中的表达规律。但是Smad5如何调控内耳发生、发育等需要进一步的研究。从分子水平了解内耳的发育机制是找寻听力障碍治疗方法的基础，应用分子生物学技术在基因水平对听力障碍的研究无疑是未来的发展趋势之一。【参考文献】 1Chang W, Nunes FD, De-Jesus-Escobar JM, et al. 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