实用双向电泳教程.doc

双向电泳实验教程一、实验过程1、蛋白质干粉的制备可溶性蛋白提取法1于超低温冰箱中取样品取出水稻材料样品3g2放到研钵中，液氮研磨充分，移入50ml离心管中3加入15ml提取缓冲液，震荡摇匀15-30 min，于冰山超声1h411000rpm，4，15min，取上清5再加入15ml提取缓冲液，震荡摇匀15-30 min，11000rpm，4，15min，取上清6合并上清，加入4倍体积TCA/丙酮溶液，11000rpm，4，20min，弃上清7丙酮清洗3次然后真空抽干8按适当比例加入裂解缓冲液，室温超声溶解12h9. 11000rpm，15min，取上清即为蛋白样品10样品放置于-20冰箱TCA丙酮法1于超低温冰箱中取样品取出水稻材料样品3g2放到研钵中，液氮研磨充分，移入50ml离心管中3加入TCA抽取液20ml,震荡，-20沉淀过夜411000rpm，4，15min，去上清5加入20ml-20预冷的冷丙酮（内含0.07%-巯基乙醇）震荡，静置2h，然后11000rpm， 15min，去上清（一般重复3次，洗至沉淀白色或者不能变色为止）6沉淀放于冰盒中然后放到真空干燥箱中真空抽干7按适当比例加入裂解缓冲液，室温超声溶解12h8. 11000rpm，15min，取上清即为蛋白样品（此步剩下的残渣可以先留着）9样品放置于-20冰箱药品配方：TCA/丙酮抽取液：25gTCA（10%），0.07%-巯基乙醇定容于250ml丙酮中 苯酚提取法1于超低温冰箱中取样品取出水稻材料样品3g2放到研钵中，液氮研磨充分，移入50ml离心管中3加入蛋白提取液15ml,震荡使其混合均匀即可，于冰上放置30min4加入等体积的Tris平衡酚，震荡使其混合均匀，于冰上放置30min511000rpm，4，,20min，收集上层酚层。6. 用抽提液洗酚层2次7.加入5倍体积的甲醇醋酸铵，沉淀静止过夜811000rpm，4，,30min，去上清9. 用洗液1洗涤沉淀，11000rpm，4，,30min，去上清10用洗液2洗涤沉淀，11000rpm，4，,30min，去上清11沉淀放于冰盒中然后放到真空干燥箱中真空抽干12按适当比例加入裂解缓冲液，室温超声溶解12h，溶解的样品即为蛋白样品13,。将样品放置于-20冰箱中保存。药品配方：蛋白提取液1%PVP，0.7M蔗糖，0.1M Kcl，0.5M Tris-Hcl，500Mm EDTA.2Na，1mM PMSF,2%-Me洗液180%丙酮（0.07%-Me）3洗液2100%丙酮（0.07%-Me）2、样品的溶解 取蛋白干粉10mg于1.5ml的离心管中，加入200250ul裂解液（先加100-200ul左右，用小棒研磨后，再逐次加入余量裂解液，冲洗小棒），振荡1min左右，于35水浴2.5小时，15000rpm离心15min，取上清液作为实验备用。3、Bradford法测蛋白含量 1)、将牛血清白蛋白(BSA)配成1mg/ml的溶液贮存于4冰箱 2)、设7个浓度梯度制作标准曲线，每个梯度设3个重复，依下表加入1mg/ml BSA、0.1M Hcl、ddH2O。(均使用10ml离心管)管号0123456789ddH2O(ul)90807060504030201001mg/ml BSA(ul)01020304050607080900.1M Hcl10101010101010101010 3)、每管加入5ml Bradford工作液，摇匀，5min后测波长595nm下的吸光值。测定过程中，每测完1管，比色皿用95%乙醇冲洗后再用蒸馏水冲洗3次，然后取少量下1管的溶液润洗比色皿2次。 4)、制作BSA含量与OD595关系的标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为 OD值，X为蛋白含量。 a、b及相关系数通过输入数据，作图，软件分析可得。其中R2最好大于0.95。 5)、样品液蛋白质的定量 取10ul样品液,加入10ul 0.1M Hcl,80ul ddH2O,加入5ml Bradford工作液，操作方法与制作标准曲线相同。根据定量结果计算样品液的取量及加入水化液的量。4、第一向电泳IEF1)、依据定量结果取适量上清液，加泡胀液至终体积为0.45ml，振荡片刻,15000r离心5min除杂质，取上清用于上样。2)、选用24cm长IPG胶条，将IPG胶条从-20取出后置室温下放置5min。向IPG胶条槽(strip holder)中加入0.45ml溶有样品的泡胀液后，再将IPG 胶条去掉保护膜，胶面向下放入胶条槽中，酸性端对应正极，碱性端对应负极；慢慢的抬高或放低胶条，除去胶面与泡胀液间的气泡，然后滴加0.7-0.8ml覆盖油，盖上胶条槽的盖子，放于Ettan-IPG等电聚焦仪(IPGphor)上，泡胀和等电聚焦的参数见表1。再水化及等电聚焦条件均设置为20，50uA/strip。IEF 参数设置steps12345Voltage(v)50010008000(gradient)80001000Time(h)163430S1、S2用于去小离子，并有利于高分子量蛋白进入胶条，S3和S4用于聚焦，为防聚焦完毕后无人值守或其它操作尚未完成而设置了S5。(进行等电聚焦之前，先让泡胀液与胶条充分接触，一般过夜或者12h)*在进行IEF时，室温易保持在20-23之间为宜，以免IPGphor的电板出现冷凝水而可能导致的仪器短路事故。5、胶条平衡等电聚焦后，用镊子迅速取出IPG胶条(夹住负极端)，用滤纸上放置片刻(胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸)，以正极端（即酸性端）向下，负极端（即碱性端）向上放入平衡管中，平衡(15ml)和平衡(15ml)分别平衡15min。取出胶条后用滤纸小心吸去残余平衡液，用电极缓冲液润洗1秒钟，准备转移至第二向SDS-PAGE胶上。* 平衡时要注意保持胶面始终向上,不能接触平衡管壁。6、第二向电泳SDS-PAGE将平衡好的IPG胶条贴于凝胶玻璃板上，移至分离胶上端，避免IPG胶条与SDS-PAGE胶上沿间产生气泡。将10ul低分子量标准蛋白于沸水中煮5min，剪一张0.3cm0.5cm的滤纸片，置于胶条的酸性端，吸取标准蛋白液至滤纸片上，用封胶液(不能太热，50左右为宜)封住胶条及滤纸片，待封胶液凝固后，在电泳槽中放上上槽，将凝胶板插入EttanTM DALTII的缓冲液柜中，用代用板插满空位置。在18水循环条件下进行电泳，起初恒流10mA/胶 30min后，换用50mA/胶，待示踪溴酚蓝至凝胶底部边缘时停止电泳。7、蛋白质检测电泳结束后，剥下胶板，放入染色液中于室温摇床摇动染色8h, 随后经脱色液脱色处理至背景变浅、蛋白点清晰可见，其间更换脱色液数次。脱色后的凝胶用蒸馏水冲洗3次，用Image Scanner电泳扫描仪进行扫描，分辩率设置为300dpi(或600 dpi)、24位全彩。二、相关溶液配置1、提取液：可溶性提取缓冲液（20 mM Tris-Hcl，pH8.0，20 mM Nacl，20 mM PMSF，10 mM DTT）100mmol/LTris、50mmol/L抗坏血酸、100mmol/L氯化钾、50mmol/L硼砂、1Triton X100、2%巯基乙醇。1.5mmol/LTrisHcl 13.3ml抗坏血酸 1.76gKcl 1.49g硼砂 3.81gPMSF 0.035gTriton X100 2ml巯基乙醇 4mldd H2O to 200mlTCA/丙酮抽取液：25gTCA（10%），0.07%-巯基乙醇定容于250ml丙酮中可溶性蛋白提取液：1%PVP，0.7M蔗糖，0.1M Kcl，0.5M Tris-Hcl，500Mm EDTA.2Na，1mM PMSF,2%-Me洗液180%丙酮（0.07%-Me）3洗液2100%丙酮（0.07%-Me）2、裂解液： 7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%(W/V) CHAPS、2%(V/V)两性电解质载体，20保存。Urea 4.2 g Thiourea 1.5224 g CHAPS 0.4 g Pharmelyte 310 50 uldd H2O to 10 ml注：1)使用前加入20mMDTT(根据不同样品，加入DTT的量可作适当调整，如20、30、40、50mMDTT等)。 2) Pharmelyte 的PH值最好与胶条的范围一致。3、 水化液：7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、2%(W/V)CHAPS、0.5%(V/V) IPG buffer，20保存。Urea 2.1 gThiourea 0.75 gCHAPS 0.1 gBromophenol blue(1%) 10 uldd H2O to 5 ml注：使用前每1 mL 水化液加5ul IPG IPG buffe，加入的DTT量与裂解液中的用量相同，然后加入痕量溴酚蓝，用前加入少量DTT和10ulPH3-10的电解质。4、1%溴酚蓝贮液Bromophenol blue 100 mgdd H2O to 10 ml5、 平衡液：50 mmol/L Tris-HCl pH8.8、尿素6 mol/L、30%(V/V)甘油、2%(W/V) SDS、少量溴酚蓝，20保存。Tris-HCl, pH 8.8 10 mlUrea 72.07 gGlycero(87%) 69 mlSDS 4 gdd H2O to 200 ml使用前，2次平衡分别加入：平衡液：每10ml平衡液加DTT100mg；平衡液：每10ml平衡液加碘乙酰胺250mg。6、 SDS-PAGE凝胶储液：30%(W/V)丙烯酰胺，0.8%(W/V)甲叉双丙烯酰胺，保存于棕色瓶，4Acrylamide (FW 71.08): 60.0 g N,N-Methylene bisacrylamide (FW 154.17) 1.6 g ddH2O To 200 ml 7、 SDS-PAGE凝胶缓冲液：1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，4 保存。 Tris base (FW 121.1) 36.34 gddH2O about 100150 ml 浓HCl adjust to pH 8.8ddH2O to 200 ml8、 SDS-PAGE 电极缓冲液：Tris 0.025 mol/L，甘氨酸0.192 mol/L，0.1%(W/V) SDS，pH 8.3。可先配成10X SDS electrophoresis buffer，使用前再稀释。10倍电极缓冲液： Tris base 12.1 g；glycine 57.6 g；SDS 4.0 g ddH2O to 400 ml 9、封胶液： SDS elctrophoresis buffer 100 mlAgarose 0.5 g10、染色液(200ml)：磷酸 100ml硫酸铵 100gG250 1.2g甲醇 200ml11、脱色液：甲醇 50ml乙酸 70ml+ 蒸馏水 to