微生物综合实验 (09).doc

综合性实验实验一、噬菌体的分离和纯化及效价测定病毒是一类个体极小的超显微生物,必须借助电子显微镜才能观察到。病毒没有细胞结构，大多数病毒是蛋白质和核酸组成的大分子，每种病毒的核酸或是RNA或是DNA。它们是专性寄生物，不能独立进行代谢活动和繁殖，只能在特异的宿主细胞内进行复制。根据宿主的不同，可将病毒分为动物病毒(包括昆虫病毒)、植物病毒和细菌病毒噬菌体等。由于病毒是专性寄生物，因此还不能用人工培养基进行培养，对病毒的培养和测定主要依靠实验性感染，例如细菌病毒(噬菌体)需要对特异性细菌进行感染：植物病毒进行实验性植物感染，而动物病毒常用鸡胚培养和组织培养来代替动物的实验性感染：昆虫病毒则用昆虫感染或组织培养。一、实验目的1、学习噬菌体分离、纯化的基本原理和方法。2、观察噬菌斑，学习噬菌体效价测定的基本方法。二、基本原理因为噬菌体是专性寄生物，某种噬菌体往往只能感染一种或和它相近的某种细菌，其分布一般取决于宿主细菌的分布，所以自然界中凡有细菌的地方，均可发现其特异的噬菌体的存在。例如粪便和阴沟污水中含有大量大肠杆菌，在其中能很容易地分离到大肠杆菌噬菌体：乳牛场有较多的乳酸杆菌，容易分离到乳酸杆菌噬菌体等。虽然近年的研究表明，自由噬菌体颗粒可以在环境中短期独立存活，对自然条件有一定的耐受能力，又受到自然流动的散布，不一定总是和其宿主细菌同时存在，但没有宿主细菌的地方，其特异噬菌体的数量比较少。大多数烈性噬菌体DNA (或RNA)侵入细菌细胞后迅速进行复制、转录和系列基因的表达并装配成噬菌体颗粒，通过裂解宿主细胞或通过挤出(exclude)宿主细胞(宿主细胞不被杀死，如M I3噬菌体)而释放出来，可使混浊的菌悬液变为澄清或比较清，此现象可指示有噬菌体存在。也可利用这一特性，在样品中加入敏感菌株和液体培养基，进行培养，使噬菌体增殖、释放，从而分离到特异的噬自体。在有宿主细菌生长的固体琼脂平板上，噬菌体可裂解细菌或限制被感染细菌的生长从而形成透明的或混浊的空斑，称噬菌斑，一个噬菌体产生一个噬菌斑，利用这一现象可将分离到的噬菌体进行纯化和测定噬菌体效价。噬菌体的效价就是1m1养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法，一般采用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑，因此能迸行噬菌体的计数。但困噬菌斑计数方法实际效率一般偏低，因为有少数活噬菌体可能未引起感染，所以为了准确地表达病毒悬液的浓度(效价或滴度)一般不用病毒粒子的绝对数量而是用噬菌斑形成单位plague-forming units，简写成pfu)表示。本实验是从不同环境中分离原核微生物的噬菌体，然后进一步纯化，并对纯化后的微生物裂解液进行噬菌体效价的测定。三、材料和仪器1.菌株（实验室中现有菌株自选）：选1株2.培养基：500ml三角烧瓶内装3倍浓缩的细胞微生物培养基100m1，试管液体养基，上层琼脂培养基(含琼脂0.7%，试管分装，每管4ml)，底层琼脂平板(含培养基10m1，琼脂2%)。3.仪器及其他用具：灭菌玻璃涂棒，灭菌吸管，无菌滤器(孔径0.22m)，恒温水浴箱，真空泵等。4.噬菌体分离源：阴沟污水，自然海水等（视宿主菌而定）四、操作步骤1.噬菌体的分离(1)制备菌悬液：(2)增殖培养。在l00m1 3倍浓缩的液体培养基的三角烧瓶中，加入噬菌体分离源水样品200ml和宿主菌悬液2m1，37振荡培养1224h。(3)制备裂解液。将以上混合培养液2500r/min离心15min。将无菌滤器用无菌操作安装于灭菌抽滤瓶上，规操作连接真空抽滤装置。将离心上清液倒入滤器，开动真空泵，过滤除菌。所得滤液经37培养过夜，作无菌检查。液体抽滤完毕，应打开安全瓶的放气阀增压后再停真空泵，否则将产生滤液回流，污染真空泵。(4)确证试验。经无菌检查没有宿主菌生长的滤液作进一步证实噬菌体的存在。于琼脂平板上加一滴细菌悬液，再用涂棒将菌液涂布均匀。待平板上菌液干后，分散滴加数小滴滤液于平板菌层上面，置37培养过夜。如果在滴加滤液处形成透明噬菌斑，便证明滤液中有宿主菌噬菌体。2.噬菌体的纯化(1)如己证明确有噬菌体存在，则用接种环取滤液一环接种于液体培养基内，再加入0.1ml宿主菌悬液，混匀。(2)取上层琼脂培养基，融化并冷却至48(可预先融化、冷却，放48水浴箱内备用)，加入以上噬菌体和细菌的混合液0.2m1,立即混匀。(3)立即倒入底层琼脂平板上，铺匀。置37培养24h。(4)此法分离的单个噬菌斑，其形态、大小常不一致，需要进一步纯化。噬菌体纯化的操作比较简单，通常采用接种针(或无菌牙签)在单个噬菌斑中刺一下；小心采取噬菌体，接入含有宿主菌的液体培养基内，37培养。(5)待管内菌液完全溶解后，过滤除菌，即得到纯化的噬菌体。3.高效价噬菌体的制备刚分离纯化所得到的噬菌体往往效价不高，需要进行增殖。将纯化了的噬菌体滤液和液体培养基按1:10的比例混合，再加入宿主菌悬液适量(可和噬菌体滤液等量或1/2的量),培养，使增殖，如此重复移种数次，最后过滤，可得到高效价的噬菌体制品。4.噬菌体效价的测定(1)将4管含0.9ml液体培养基的试管分别标写10-3，10-4，10-5和10-6。(2)用1m1无菌吸管吸分离纯化培养的10-2宿主菌噬菌体0.1ml，注入10-3的试管中，旋摇试管进行混匀。(3)用另一支无菌吸管从103管中吸0.1ml加入10-4管中，混匀，余类推，稀释至104管。(4)将5支灭菌空试管分别标写10-4，10-5， 10-6和10-7和对照。(5)用吸管从10-3噬菌体稀释管吸0.1ml加入10-4的空试管内，用另一支吸管从104稀释管内吸0.1ml加入10-5空试管内,直至10-7管。(6)将宿主菌培养液摇匀，用吸管取菌液0.9ml加入对照试管内，再吸0.9ml加入10-7管，如此从最后一管加起，直至10-4管，各管均加0.9ml宿主菌培养液。(7)将以上试管旋摇混匀。(8)将5管上层培养基融化，标写10-4，10-5， 10-6、10-7和对照。冷却至48，并放入48水浴箱内。(9)分别将4管混合液和对照管对号加入上层培养基试管内。每一管加入混合后,立即旋摇混匀。(10)将旋摇均匀的上层培养基迅速对号倒入底层平板上，放在台面上摇匀，使上层培养基铺满平板。(11)凝固后,置37培养。(12)观察记录。观察平板中的噬菌斑，将每一稀释度的噬菌斑形成单位(pal)记录于实验报告表格内，并选取30300个ph数的平板计算每毫升未稀释的原液的噬菌体效价。噬菌体效价=pfu数稀释倍数10五、实验报告1.结果(1)绘图表示平板上出现的噬菌斑。(2)记录平板中每稀释度的ph数于下表中,并计算所得噬菌体的效价。噬菌体稀释度10-410-510-610-7对照pfu数2.思考题(1)能否用伤寒杆菌(肠道菌)悬液作为宿主细胞分离大肠杆菌(肠道菌)的噬茵体，为什么?(2)试比较分离纯化噬菌体和分离纯化细菌、放线菌等在基本原理和具体方法上的异同。(3)新分离到的噬茵体滤液要证实确有噬菌体存在，除本实验用的平板法观察噬茵斑的存在以外，还可用什么方法？如何证明？(4)如果在你的测定平板上，偶尔出现其他细菌的菌落，是否影响你的噬菌体效价测定？(5)什么因素决定噬茵斑的大小？六、注意事项加宿主菌增殖的污水裂解液一定要过滤除菌，不过滤的污水会因为还含有其他细菌的存在，而这些细菌不能作为宿主菌噬菌体的宿主，将会在平板上生长出正常的菌落,有可能观察不到噬菌斑。噬菌体纯化的关键是在平板上得到单个噬菌斑，能否达到目的，决定于所分离得到的噬菌体滤液的浓度和所加滤液的量，最好在做无菌试验时，先做预备试验，若平板上的噬菌斑连成一片，则需减少接种量(少于一环)或增加液体培养基的量；若噬菌斑太少，则增加接种量。在计算噬菌体效价时，要注意控制稀释度，一般选择30-300个pfu的平板计数较好，pfu太少误差比较大；太多则有可能相连，影响计数。七、参考文献1祖若夫,胡宝龙,周德庆.微生物学实验教程.上海:复旦大学出版社,1993.2黄秀梨.微生物学实验指导.北京:高等教育出版社,1999.3沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验.北京:高等教育出版社,1999.实验二、微生物固定化培养技术一、实验目的1、 了解微生物细胞固定化的原理及其优缺点。2、 掌握固定化细胞中最基本、最常用的方法。3、 掌握简单的文献检索及实验设计方法。4、了解微生物代谢产物或包内物质的测定方法。二、基本原理生物固定化技术是现代生物工程领域中一项新兴技术，能使生物催化剂(酶、微生物细胞、动植物细胞、细胞器等)得到更广泛、更有效的应用。一般可以通常包括以下的相互作用将微生物固定化：1带电荷细胞和带电荷的载体之间的静电相互作用。2细胞表面的氨基(-NH2)和竣基(-COOH)和载体表面上的反应基之间形成离子键。3细胞表面的氨基或竣基和载体表面楚基等形成部分共价键。4包埋载体的孔径比生物催化剂更小，因而使生物催化剂保留在内，同时底物可以进去，反应物可以出来。5细胞表面的基团和载体上经过化学修饰而特异结合上去的基团形成共创键。目前经常采用的生物催化剂固定化方法主要有：吸附法、包埋法、交联法和膜截留法。微生物细胞的固定化方法，以包埋法最常用。包埋法是将微生物封闭在天然分子多糖类或合成高分子凝胶的网络中，从而使微生物固定化。其特点是能将固定化微生物制成各种形状(球形、块形、圆柱形、膜状、布状、管状等)，并且固化后的微生物能繁殖，所以对它的研究最多，应用最广。吸附法是将微生物细胞附着于固体载体上，微生物细胞和载体之间不起化学反应。该操作条件温和，细胞活性损失少，载体可以反复使用。其缺点是微生物和结合不牢，易脱落。交联法是使用双功能或多功能试剂，如醛和胶，使酶或微生物细胞之间或它们和载体之间进行反应，从而将酶或细胞进行固定化，使酶或微生物细胞之间彼此附着相连。交联剂有很多，主要有戊二隆、聚乙烯亚胶等。膜截留法是采用半透膜、中空纤维膜、超滤膜等截留酶和细胞，使生物催化剂不能透过此膜，而产物和底物可以透过。所以它也是固定化细胞的一种方式。随着固定化技术的发展，人们又提出了联合固定化技术(co-immobilization)。它是指外来酶结合于固定化完整细胞上。后来又发展到将两种酶、两种微生物细胞或生物催化剂(酶、细胞和底物或其他物质联合固定在一起。联合固定化技术是酶、细胞固定化技术发展的新成果。常用的固定化载体包括各种无机吸附材料和有机高分子材料。有机高分子材料分为天然高分子多糖和合成高分子化合物：天然高分子多糖如琼脂、卡拉胶、海藻酸钠等，合成高分子化合物如聚乙烯醇、聚丙烯酷胶、光敏树脂等。各种固定化方法和载体都有其特点(表171)，根据菌种的特性选择不同的载体和固定化方法。表1各种固定化方法比较性能交联法吸附法共价结合法包埋法制备难易适中易难适中结合力强弱强适中活性保留低高低适中固定化成本适中低高低存活力无有无有适应性小适中小大稳定性高低高高载体的再生不能能不能不能空间位阻较大小较大大从海藻提取获得的藻酸盐常为钠盐为D-甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的线性共聚物，外加阳离子(如Ca2+、A13+)可诱导凝胶形成，作为微生物细胞包埋的载体，微生物细胞包埋于藻酸钙凝胶中的方法主要有两种类型，即外交凝法和内交凝法，前者应用较广。外交凝法的基本方法是将微生物细胞和藻酸钠溶液混和后，通过一注射器针头或相似的滴注器将上述混合液滴入CaC12溶液中，Ca2+从外部扩散入藻酸钠一细胞混合液珠内，使藻酸钠转变成不溶的藻酸钙凝胶，由此将细胞包埋其中。用于外交凝法制备藻酸钙凝胶装置有简单滴法固定化装置，能满足一般实验室制备珠状交需求，也可用一般医用注射器进行改装。另一种装置由Hulst等发明，利用共振将待固定化混合物射流断裂成均匀的微滴后，注入持续搅拌的CaC12溶液中形成胶珠，此装置可满足工业化生产需要。内凝法是利用柠檬酸钙在酸性条件下释放钙离子，可使藻酸纳形成凝胶，先将藻酸钠溶液和待固定细胞混匀，然后加入柠檬酸钙，再立即加入D-葡萄糖酸-1，5-内酯，充分混匀，D-葡萄糖酸酶在水溶液极易分解并使溶液pH下降，柠橡酸钙释放Ca2+，凝胶很快诱导形成。 本实验以藻酸钙凝胶包埋法固定化微生物为例，了解微型固定化技术的基本方法及其应用。三、材料和方法（一）微生物菌株（酿酒酵母、小球藻、乳酸杆菌任选）（二）培养基配方：针对各组选择的菌株自查配方（三）固定化胶球的制备 配制2%的海藻酸钠溶液和0.2 mol/l的CaCl2溶液，高温灭菌冷却备用。将无菌海藻酸钠溶解液和培养至一定数量的菌悬液按一定比例（1：3-4）混合均匀，选用针头型号不同的注射器，将混合液缓慢的逐滴滴入0.2 mol/l的CaCl2溶液中，边滴边摇动，此时海藻酸钠中的钠离子和CaCl2中的钙离子发生置换，形成海藻酸钠凝胶网状结构，从而使细胞得以固定，静止1530min后，将会形成海藻酸钙细胞固定化胶球。（四） 固定化条件的选择（选择一组）1培养体系中胶球大小比较 用不同大小的针头滴成不同大小的菌珠，设2个平行组。2接种量的比较 用104，105，106cell/ml级的菌种密度，设2个平行组。3培养体系中胶球密度的比较 培养体系中胶球数200，300，400，设2个平行组。4海藻酸钠浓度和氯化钙浓度正交试验将质量分数为1%，2%，3%(g/L)的海藻酸钠溶液分别和质量分数为1%，2%，3%(g/L)的CaCl2做正交试验。（五）培养 用无菌去离子水清洗固定化胶球3次，移入250ml锥形瓶中，并加入100ml培养液培养。置于适宜温度进行培养发酵，培养期间要时常摇晃。（六） 测定方法 1生长率的计算 根据公式 K=（lnNtlnN0）T其中N0是开始的细胞数，Nt是经过T时间后的细胞数。T代表一段生长的时间，K为相对生长常数，代表生长效率。2细胞数量的测定 方法1、取相培养一定时期的胶球n粒，分别测定其直径并计算胶球体积，加入一定体积的5%的柠檬酸钠溶液溶解胶球并用血球记数板在显微镜下计算