卵巢颗粒细胞体外培养体系的建立及ＤＥＨＰ、ＭＥＨＰ对其增殖功能的影响.doc

卵巢颗粒细胞体外培养体系的建立及、对其增殖功能的影响【摘要】目的：建立卵巢颗粒细胞的原代培养体系，探讨邻苯二甲酸二（乙基）己酯（）及其活性中间产物邻苯二甲酸单（乙基）己酯（）对原代培养的卵巢颗粒细胞增殖作用的影响。方法：选用日龄未成年雌性大鼠，皮下注射孕马血清（），后断头处死，收集卵巢颗粒细胞，在培养液中培养。卵巢颗粒细胞原代培养体系建立成功后分别将不同剂量的（、）和（、）作用细胞及，以法检测细胞增殖情况。结果：作用卵巢颗粒细胞时，和均能明显抑制卵巢颗粒细胞增殖，差异有统计学意义（.）。作用卵巢颗粒细胞时，和均能明显促进卵巢颗粒细胞增殖，差异有统计学意义（.）。而作用卵巢颗粒细胞及，各染毒剂量组均无统计学差异（.）。结论：能促进卵巢颗粒细胞增殖，并且和作用时间长短有关。在观察剂量下，尚未显示有促进卵巢颗粒细胞增殖的作用。 【关键词】 ；细胞增殖；卵巢颗粒细胞（）（） ， （，） ：，（）（）：，μ、μ、μ、μ、μμ、μ、μ、μ、μ，：μμ，（.）μμ，（.），（.）：， ； 大鼠卵巢颗粒细胞培养方法的研究始于二十世纪七十年代初，经不断改进、完善，现已成为研究生殖生理和内分泌等的一种重要手段。近年来开始用于生殖毒理学的研究，特别是在毒作用机制研究上有良好的应用前景，可能成为雌性生殖毒性研究中重要的实验系统。邻苯二甲酸二（乙基）己酯（）作为聚氯乙烯（）等塑料制品的增塑剂，被广泛应用于食品包装材料、容器、医疗用品、化妆品及人造革等制造行业。由于在产品的加工过程中，并未聚合到高分子的碳链上，因此，随着时间的推移，可不断释放出来。在环境中难以降解，在土壤，水域，空气及大气沉降物中广泛存在，已造成全球性的环境污染，并可在自然界生态系统内通过食物链在生物体内富集，从而对人类的健康造成危害，有学者将其描述为产量最大的人类制造的环境污染物之一。由于女性特殊的生理特点和生活习惯，暴露的机会明显高于男性，因而引起了人们对与女性生殖健康的关注。动物实验结果表明染毒具有正常排卵周期的成熟雌性大鼠天，可导致大鼠自然排卵周期改变，动情周期延长，受试大鼠卵泡体积减少，而卵泡体积减少是由于卵泡颗粒细胞变小的结果，作用位点主要是卵巢颗粒细胞。等研究表明青春期前雌性大鼠吸入暴露可影响青春期发育和生殖功能。是的活性代谢产物。等人研究了对卵巢颗粒细胞的影响，发现它可以导致颗粒细胞中作为雄激素向雌激素转化的限速酶—芳香化酶水平的下降。本次实验通过建立卵巢颗粒细胞的原代培养体系，检测及对原代培养的卵巢颗粒细胞的增殖功能的影响，进一步探讨及的雌性生殖毒性的机制。 材料与方法 . 实验动物 日龄幼年大鼠，体重，由沈阳医学院实验动物中心提供。 . 主要试剂 邻苯二甲酸二（乙基）己酯（），纯度：，购于公司；邻苯二甲酸单（乙基）己酯（），纯度：，批号，购于公司；二甲基亚砜（），纯度：.，批号，购于公司；培养基，批号：，购于海克隆生物制品有限公司；小牛血清购于中国科学院生物工程研究所；试剂购于日本同仁化学研究所；孕马血清购于上海市计划生育科学研究所。 . 主要仪器 培养箱，型号：，购于电子公司；酶标仪，型号：，购于美国公司；超净工作台，型号：，购于北京东联哈尔仪器制造有限公司；倒置显微镜，型号：，购于重庆光学仪器厂。 . 细胞的原代培养 取只日龄未成年雌性大鼠，皮下注射只，后断头处死。在无菌条件下立即取出卵巢，刺破其表面的成熟卵泡，使释放入的培养液中，过滤后离心收集细胞，用洗次后加入培养液（含小牛血清青、链霉素）重悬细胞，.台盼蓝染色计数。经台盼蓝染色表明，细胞存活率。将细胞种入孔培养板中（培养板孔内先涂布多聚赖氨酸），每孔μl含细胞.×个，在、温箱中预培养。经预培养后，细胞可贴壁生长。 . 卵巢颗粒细胞的鉴定 细胞培养后，用.胰酶消化，制成单细胞悬液，用冲洗次，多聚甲醛固定，染色可见细胞形态完整，呈多角形，核呈深蓝色，胞浆淡红色并含有许多颗粒，确认为卵巢颗粒细胞。 . 细胞传代培养及实验前处理 用含小牛血清的培养液培养卵巢颗粒细胞，条件为、。吸出培养液，加入清洗，然后加入.胰酶消化，孵育，加入等体积含血清培养液终止胰酶反应，用吸管吹打成细胞悬液；转移至离心管离心（，），再用无血清的培养液调整细胞浓度为×，接种于孔板（μ孔），置于、饱和湿度培养箱内培养。 . 实验分组及处理 直接将药液加入培养好的卵巢颗粒细胞中，观察不同剂量的和分别加入各孔中，每孔加入μ，终浓度为μ、μ、μ、μ和μ，同时设等体积的.阴性对照组，每个剂量复设六孔，及后检测指标。 . 细胞增殖实验（法） 实验终点在每个孔内加入μ的试剂，把培养板放在培养箱内继续培养，然后在酶标仪上于波长处测定各孔值。 . 统计学方法 应用软件建立数据库，数据以均数标准差（）表示，并采用统计软件进行单因素方差分析（），组间两两比较用检验，检验；.有统计学意义。 结果 . 卵巢颗粒细胞原代培养及鉴定（图、） 由图、可见，染色细胞形态完整，呈多角形，核呈深蓝色，胞浆淡红色并含有许多颗粒。此细胞即为卵巢颗粒细胞。 . 对卵巢颗粒细胞增殖的影响（表1）图 低倍镜下卵巢颗粒细胞的形态（×）图 低倍镜下卵巢颗粒细胞的形态（×）表 作用卵巢颗粒细胞和细胞增殖情况与对照组比较，）. 与对照组比较，在和时，μ和μ均明显抑制卵巢颗粒细胞增殖，差异有统计学意义（.）。 . 对卵巢颗粒细胞增殖的影响（表2） 表 作用卵巢颗粒细胞细胞增殖情况与对照组比较，在和时，各染毒剂量组均无统计学差异（.）。 讨论 本研究显示，卵巢颗粒细胞在体外生长良好，基本能够维持正常生理功能，但通过计数细胞，发现细胞的数量比较少，其原因可能是由于卵巢颗粒细胞形态较大，很容易铺满培养瓶，故建议用大容量培养瓶传代培养。 的雌性生殖毒性作用主要是通过其代谢产物单（乙基己基）邻苯二甲酸酯（）影响卵巢功能，作用位点主要是卵巢颗粒细胞。体外试验表明，在卵巢颗粒细胞培养时，加入可使类固醇合成能通路中芳香化酶的绝对量和活性改变。然而，本实验的研究结果表明作用卵巢颗粒细胞，不能使卵巢颗粒细胞良好增殖，因此，的增殖适宜浓度和时间尚须进一步探讨。 等也发现了可影响颗粒细胞的功能，降低刺激颗粒细胞的生成量，抑制孕激素生成。本实验的研究结果亦表明作用卵巢颗粒细胞，可使卵巢颗粒细胞良好增殖。【参考文献】 张天宝，杨在昌，李红霞，等大