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绿色荧光蛋白（GFP）的转化表达及免疫印迹检测王媛 0811142南开大学 生命科学学院 生物技术 08级一、摘要：本实验利用酶切方法检测载体中所含GFP片段后，通过转化的方法把绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌进行表达，通过免疫印记杂交方法（western blotting）分析GFP在大肠杆菌中的表达，在分离检测的全过程中（转化平板，细胞裂解，电泳，电转移），均可通过紫外灯清晰地检测到颜色亮丽的绿色荧光蛋白。关键词：绿色荧光蛋白 免疫印记杂交 二、引言：绿色荧光蛋白是一种源于水母(Aequorea Victoria)等海洋无脊椎动物的蛋白，分子量为26.9KD。GFP的开放阅读框架长度约为740bp，编码238个氨基酸残基。GFP表达后折叠环化，在氧存在下，由6567位的氨基酸残基环化，形成发色基团，无需添加任何酶和底物，在长紫外或蓝光激发下就能发荧光，荧光性质稳定，可保持10分钟。GFP能在不同的细胞内稳定表达，无种属、组织和位置特异性，对细胞无毒性且检测方法简单，将其作为报告基因已广泛应用于细胞生物学和分子生物学领域。免疫印记又称蛋白质印记，是在凝胶电泳技术和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种免疫检测技术。其原理是将膜与胶放在中间，上下加滤纸数层，做成“Sandwich”样的转移单位，并且保证带负电的蛋白质向阳极转移，即膜侧连接阳极或面向阳极，从而将电泳分离的蛋白从凝胶转移至固相载体上。三、实验材料、仪器及方法： 3.1 实验材料 3.1.1 菌种 E.coli DH5(pETH)菌株 E.coli DH5(pETH-GFP)菌株 E.coli BL21菌株 E.coli BL21 (pETH)菌株 E.coli BL21 (pETH-GFP）)菌株 3.1.2 试剂与材料 LB培养基（自己配置灭菌）Amp（100mg/ml）IPTG(10mg/ml) CaCl2(1M) 50*TAE Acry/Bis贮存液 分离胶缓冲液 浓缩胶缓冲液 泳动缓冲液（5*） 上扬缓冲液（5*） 转移缓冲液 PBS 1.5% A.P.S 质粒小量提取试剂盒 Eco RI限制性内切酶 DNA Maker Protein Maker pH试纸 3.1.3 仪器 紫外检测仪、超声波细胞粉碎机、垂直板式电泳系统、半干式蛋白质印迹电转移系统等。 3.2 实验方法1、配置LB培养基，包括液体、固体培养基后灭菌；分别接种pETH-GFP/DH 5（LA 4ml）一支，pETH/DH 5(LA 4ml)一支，BL21（LB 4ml）四支2、按照protocal,利用tiangen质粒提取试剂盒分别提取pETH-GFP/DH 5、pETH/DH 5质粒后，按照酶切体系混匀后，至于37温箱酶切2h。3、制备0.8%琼脂糖凝胶，20ml每块，加入适量EB，按照点样顺序点样后，60V恒压电泳，约0.51h.后，凝胶自显影拍照（胶图见后面实验结果）4、取40lBL21菌液接种于4mlLB，37，200rpm，约2.5h,此时OD600=0.30.5，利用氯化钙法制备感受态细胞，制备完成至于冰上备用。5、铺制平板，1块LB，4块LA，冷却凝固后于37倒置烘干备用。其中两块LA平板上面涂布IPTG（100l+100l水），正置备用。6、按照阴性对照、空白对照、GFP基因转化表达、GFP基因的转化四组分别进行转化，涂板，37倒置过夜培养，紫外灯下观察，呈绿色荧光的单菌落即为转化子。记录各板菌落数7、配置泳动缓冲液（5*）100ml*2, 转移缓冲液 100ml*4,洗涤制胶槽，装好后备用，按照SDS-PAGE分离胶浓缩胶的配方，按照现配分离胶，然后浓缩胶制胶，凝固后保鲜膜包好，4过夜。接种发荧光的单菌落BL21于4mlLB，37，200rpm过夜，同时接种BL21（pETH）作为阴性。8、诱导表达发荧光及阴性对照后，利用超声破碎制备细胞裂解液。9、按照样品-Maker-阴性对照的点样顺序上样，恒压电泳，40-45V，电泳结束后取下凝胶浸泡于蒸馏水下，紫外灯下检测。10、石墨板（+）上依次放置3张浸泡转移缓冲液滤纸-硝酸纤维素膜-凝胶-3张滤纸，不可有气泡，盖上石墨板（），0.8mA/cm2,15min,转膜结束关闭电源，取出膜，紫外灯下检测。四、实验结果 4.1 核酸胶凝胶自显影图像上样顺序：1、 pETH质粒DNA2、 P质粒DNA3、 pETH质粒DNA经Eco RI酶切4、 pETH-GFP质粒DNA经Eco RI酶切5、 DNA 分子量Maker。*Maker从下到上分别表示500bp,1000bp,2000bp,3500bp,5500bp，7000bppETH-GFP质粒DNA* Maker 从下到上分别表示500bp,1000bp,2000bp,3500bp,5500bp，7000bp。 4.2 转化计算本组转化实验A、B、C三个对照实验均没有长出菌落，D组阴性对照涂于LB的板上生长出大约5768个菌落，LA板上也没有生出菌落。故转化子总数0，感受态细胞总数5768*10000*1000/200=2.884*108。因板上没有菌落故转化效率，感受态细胞转化率均不可算。4.3 电泳 转膜电泳，转膜后用紫外灯检测均可看见颜色亮丽的绿色荧光。五、实验结果分析 5.1 核酸胶凝胶自显影图像分析已知，pETH-GFP质粒DNA经Eco RI酶切后分为5400bp和740bp两个片段种源于水即为第四道所示。因为酶切后质粒呈线性，故载体较第2道完整pETH-GFP质粒DNA略偏后。第1道空载载体分子量偏大，且酶切后两个片段（第3道）大概的分子质量相加为空载，怀疑所接种菌不是带有pETH质粒DNA的菌落。 5.2 转化分析 估计原因是外源片段没有转进去或感受态细胞制备并不成功。即使LB板上长出了许多的菌落，但是并不能说明这些都是感受态细胞，可能绝大部分细胞并没有得到成功的处理。怀疑，可能制备时不够轻柔或者可能有杂菌污染（板上菌落多，没办法看清），或没能保持持续低温。实验中还应注意：1、BL21接菌于LB培养基一定不能接在LA否则不生长；2、提取质粒时应注意平衡柱子，动作轻柔，溶液混匀；3、酶切反应，注意严格按照酶切体系来，酶试剂注意低温，不要污染；4、诱导的关键是I