抗氧化维生素减轻高脂饮食兔动脉粥样硬化及保护DNA甲基化的作用.doc

抗氧化维生素减轻高脂饮食兔动脉粥样硬化及保护DNA甲基化的作用抗氧化维生素减轻高脂饮食兔动脉粥样硬化及保护DNA甲基化的作用2010-09-07 宋福津陈端霞杨堤曹秀芝易立朱文玲 【摘要】目的探讨抗氧化维生素对高脂饮食兔动脉粥样硬化(AS)及DNA甲基化水平的影响。方法用显微镜比较兔高脂饮食组，高脂抗氧化维生素组主动脉AS的程度并用高效液相色谱层析(HPLC)方法分析脾脏DNA的甲基化水平。结果高脂抗氧化维生素组较高脂饮食组兔动脉平滑肌细胞及泡沫细胞的增生明显减少，AS明显减轻，而且脾脏DNA的甲基化水平明显增高。结论抗氧化维生素有保护DNA甲基化的作用，并可能通过此作用而影响基因转录，减轻AS。可能是抗氧化维生素减轻AS的另一种因素。 【关键词】维生素类甲基化动脉硬化 The antioxidative vitamins reduce atherosclerosis and protect DNA methylation of high-fat diet rabbitsSong Fujin, Chen Duanxia, Yang Di, et al. PUMC Hospital, CAMS and PUMC, Beijing 100037 【Abstract】ObjectiveTo study the effect of antioxidative vitamins on high-fat diet rabbits in atherosclerosis and DNA methylation level. MethodsThe microscope and the HPLC was used to compare the atherosclerosis and the DNA methylation level in the high-fat diet group and the antioxidative vitamins high-fat diet group of rabbit spleen. ResultsThe methylation level was higher and the atherosclerosis level was lower in antioxidative vitamins high-fat diet group of rabbits than that in high-fat diet group. And also there was a much less hyperplasia of smooth muscle cells and foam cells in the former group. ConclusionThe results suggested that antioxidative vitamins may effect the gene transcription by protecting DNA methylation, and may therefore reduce atherosclerosis. This may be another pathway of antioxidative vitamin reducing atherosclerosis caused by high-fat diet. 【Key words】vitaminsmethylationarteriosclerosis DNA甲基化水平属于真核细胞基因表达多层次调控机制的重要一环。大量实验证明，DNA甲基化作用和基因功能密切相关，基因的转录水平与其甲基化水平成反相关1，2。现认为动脉粥样硬化(AS)是一种以平滑肌细胞增生为主的血管疾病，基因异常过度表达参与部分作用。为探讨抗氧化维生素对基因调控系统中甲基化水平及AS的影响，我们对高脂抗氧化维生素组及高脂饮食对照组的兔脾脏DNA甲基化水平和主动脉进行测定及观察。 材料与方法 一、实验材料 1.动物：日本大耳兔，月龄2个月，体重2.53.0 kg，购自农业科学院动物中心，由首都儿科研究所动物房饲养。 2.材料：Cytosine(胞嘧啶)，5-Methylcytosine(5-甲基胞嘧啶)，Thymine(胸腺嘧啶)，Uridine(尿嘧啶)，Adenosine(腺嘌呤)，Guanine(鸟嘌呤)，RNA酶(Sigma US)，Agarose(上海生产)，胆固醇(广州市化学试剂玻璃仪器批发部)，维生素E，维生素C，叶酸(北京制药厂)，-胡萝卜素(瑞士罗氏药品化学有限公司)，高效液相色谱仪(HPLC)：Backman黄金系统通用型，166检测器，126泵。层析柱：ODS柱，2504.6 mm。 二、实验方法 兔随机分成高脂饮食组5只，除正常饮食外，1.5 g胆固醇，每日给2.5 g猪油/只；高脂抗氧化维生素组5只，维生素E 100mg，维生素C 200 mg，每日给-胡罗卜素5mg/只，其余同高脂饮食组。喂养3个月后处死动物。 1.病理：各组兔以外力处死，在距主动脉瓣根部5 mm处定点取材，石蜡切片，HE染色光学显微镜观察。 2.兔脾脏细胞核DNA抽提及DNA甲基化水平测定方法仿照文献3：每组5只兔，每只兔脾脏定位取材，称0.5 g，用生理盐水冲洗，放入含0.5 ml预冷的RSB(0.01 mol/L pH 7.4, 0.01 mol/L NaCl, 0.025 mol/L EDTA pH 8.0)缓冲液的玻璃管中，在冷酒精浴中电动匀浆至组织块消失。转移至1.5 ml的Eppendof管中，加10%SDS 70l，65水浴30分钟后，加蛋白酶K到终浓度100 g/ml，55滚动消化至有形成分消失。加入等体积酚振摇，12000 rpm/min离心15分钟，取上层水相，再酚抽提1次，25241的酚、氯仿、异戊醇抽提2次，加RNA酶终浓度到100 g/ml，37保温1小时用等体积酚及等体积25241的酚、氯仿、异戊醇各抽提1次。取上清液，加2体积无水酒精，1/10体积醋酸钠(0.3 mol,pH 8.0)，沉淀DNA，12000rpm/min，离心10分钟，无水酒精洗一次，溶于TE液。于260nm和280nm测定吸光度，计算DNA的含量，算出A260/A280的比值。其比值在1.7左右。1%琼脂糖凝胶电泳2小时，紫外线灯下观察，分子较大。将DNA用2倍的冷乙醇沉淀后，真空抽干，用氰氟酸(100l/1mg DNA)于80水解80分钟，真空抽干，重新溶于洗脱剂中(0.02mol/L的磷酸二氢铵缓冲液，pH 2.3)，然后于HPLC上测定碱基含量。洗脱液流速是2.5ml/min，检测器波长为280nm。上样量20l。 结果 一、光学显微镜观察 高脂饮食组主动脉内膜脂质斑块弥漫增厚，平均泡沫细胞1012层，部分斑块中平滑肌细胞增生明显。高脂抗氧化维生素组主动脉内膜脂质斑块明显减轻，平均泡沫细胞5层左右，平滑肌细胞明显减少(图13)4。 二、甲基化水平测定 图1正常饮食组：兔主动脉内膜无明显病变 图2高脂饮食组：兔主动脉内膜脂质斑块明显增厚，斑块内有增生的平滑肌细胞和大量的泡沫细胞 图3高脂抗氧化维生素组：兔主动脉内膜脂质斑块增厚，斑块内有较多的泡沫细胞 各组细胞核DNA水解后，用HPLC分析所得层析图谱表明，无尿嘧啶存在，也即本实验所测碱基成分仅为DNA的水解产物，完全排除了RNA的干扰。甲基化水平按以下公式计算。(DNA甲基化程度用甲基化的脱氧胞嘧啶占全部脱氧胞嘧啶的百分数表示) 甲基化水平=(5-甲基胞嘧啶(5-mC)峰积面积)/(5-mC峰积面积+胞嘧啶(C)峰积面积)100 各峰积面积的数值由高效液相色谱仪自动打印出，各组数值见附表。 讨论 我们利用光学显微镜观察及用HPLC进行碱基分离、测定。结果表明，抗