石斛兰的组织培养.doc

植物组织培养课程论文石斛兰的组织培养作者：杨恩富 专业：设施农业技术班级：设农08-1班 学号：33号 指导教师：陈霞摘要：运用组织培养相关知识，对石斛兰做了简单的组织培养阐述。大致方向为：（一）培养目的通过石斛兰的组织培养，加强我对石斛兰的了解以及石斛兰在组织培养中所注意的事项，同时为学习组织培养这门课程打下坚实的基础；（二）培养方法选择石斛兰的叶片、茎段腋芽、根系在营养基中进行组织培养 ；（三）简单介绍石斛兰生根培养和炼苗技术。通过本篇论文，加强自身对石斛兰的了解，并对其生理特性有一定的认知。组织培养技术，用组织培养法繁殖植物，这是组织培养应用于生产的主要的和成效最大的实例。所以，石斛兰的组织培养，更加肯定了组培价值所向。关键词：石斛兰 组织培养 炼苗一、石斛兰(Dendrobium) 的概述石斛兰(Dendrobium)属兰科多年生附生落叶或常绿草本植物，原产中国、日本及澳大利亚等国家，是一种观赏价值很高的花卉，其花姿态优美，花色艳丽多彩，花多而且花期长，深受人们喜爱。石斛兰有600种原生种 ，连混合交配种在内约有7000种。从形态上可分节生种和蝴蝶兰花形种两大类。在繁殖上，因为几乎所有的观赏类石斛都是杂种，通过种子播种不能得到大量与亲代形状一致的植株。目前石斛兰主要采用分株繁殖，繁殖速度缓慢。我国从20世纪70年代中期开始，对石斛的组织培养进行了大量研究，进展很快。但目前石斛兰的组织培养采用的外植体基本上都是茎尖、新生芽，由于每株植株体上这些材料有限，所以茎尖、新生芽作为外植体材料的组织快繁在生产上应用难度较大。虽然通过叶片诱导能够诱导出类原球茎 ，如Sagwa等采用幼茎的侧芽和顶尖的分生组织分化出类原球茎 。但由于石斛兰类原球茎的诱导机理没有研究清楚，通过类原球茎分化完整植株的途径还有很大的难度。二、外植体的选择无菌外植体的获得:从无病虫害的母株上选择健壮、叶片未展开的幼芽，用已消毒的刀片切取412cm，并将外围叶片剥除,仅留顶端 O 3cm叶鞘 ，放入锥形瓶中，用纱布封闭瓶口，自来水流水冲洗 3 0 min，然后用 7 0 酒精消毒1min，1 HgCl，处理 8min,最后用无菌水洗 45次,将外植体置入无菌烧杯,切取的芽体直径约 1.2cm、高 2.0 5.0c m，呈锥螺状，具顶芽 1个、腋芽 3 4个( 每层各有 1个) 。将芽体用 0.1 升汞溶液浸泡10min、无菌水冲洗 35次后、切除叶鞘。然后将顶芽与腋芽分开，取从下往上数第 23个腋芽作外植体( 第 1 个腋芽较难消毒，第 4个芽易成苗、较难诱导出原球茎),备用。三、石斛兰各组织诱导石斛兰叶片愈伤组织的诱导、石斛兰茎段腋芽的诱导、石斛兰根系的诱导。（一）石斛兰叶片愈伤组织的诱导1.叶片愈伤组织诱导培养基叶片愈伤组织诱导培养基以MS为基本培养基，根据生长调节剂的组成、浓度设5个处理。处理 A：MS+2，4-D5.0mg/L;处理B: MS+2, 4-D5.0mg/L+ 6-BA1.0mg/L;处理C:MS+ 2,4-D5.0mg/L+6-BA3.0mgL;处 理 D,MS+2,4-D 3.0m g/L+6 - B A1.0mg/L；处理 E，MS+2，4-D3.0m gL 。5种叶片愈伤组织诱导 培养基中均附加琼脂 6dE，蔗糖 2 OL，活性炭 3L，p H值为 5.4 5.8 。 2.叶片愈伤组织切块大小将无菌的幼嫩叶片,用解剖刀切成 1c m1c m的小块,接种在诱导培养基上。3.培养条件 温度为25，日光照12h，光照强度2 0 0 0LX 。（二）石斛兰茎段腋芽的诱导诱芽培养基 以 MS为基本培养基 ， 根据生长调节剂 的种类和浓度设 3个处理：1. MS+6-BA 4 .0 mg / L+N A A1.0 mg /L ； 2. MS+ 6 - B A 4. 0mg/L+N A A/1.0mg/ L+K T 1.0m g/ L ；3. MS+6-B A 0.5m g/L+N A A 0. 5mg/ L+C H 1. 0 m g/ L 。取无菌茎段 ，将两端用无菌解剖刀轻轻削去 23n l/ n ，将其接种到诱芽培养基上。（三）石斛兰根系的诱导设 3个不同的改良的 1/ 2 MS培 养基处理。处理 1 : 1/2 M S+I B A 2. 0 m g/ L ； 处理 2:1 / 2 MS+I B A2.0 m g/ L+肌醇 2. 0mg/ L ； 处理 3: 1/ 2 MS+I B A 2 0 m g L+香蕉汁 1 0 。培养基中内含物同“ 1.2.2 ”。选取生长健壮、高 2 c m 4上的单个芽体分别接人培养基中进行石斛兰根系的诱导。四、石斛兰生根培养将诱导出的丛生芽单个分开，可采用 以下 2种方法将其接种于生根培养基中：一步法：于 5 0 0 mL兰 花瓶 中注入 MS +花宝 1号 3g/ L+ 1.7 苹果+ 1.7 香蕉+ 1. 7 马铃薯的培养基150mL ,接人 2 0株根茎叶分化较完全 、株型整齐的健壮小苗。接种后将瓶苗置于温度 f 2 7 2 ) 、光照强度 10 0 O 20 0 0 l x ( 每天连续光照 1 0h) 、 加设水帘风机系统 的 环境下培养。一步到位定植可避免因个体差异大而导 致瓶苗商品价值的下降，培养 3 4个月后即可出瓶。二步法于 5 0 0mL兰花瓶注入 MS + 花宝 1号 2g,L + 1.7 苹果+ 107 香蕉+ 107 马铃薯的培养基 l 0 0 m L。接人 4 0 4 4株“ 一步法” 筛选后剩下的无根、 细弱小苗。 培养 1 个月后 ，按 2 0株 瓶再转接于 MS + 花宝 l号 3g /L + 1.7 苹果+ 1.7 香蕉+ 1.7 马铃薯 或 MS + 花宝 2号 3L + 1.7 苹果+ 1.7 香蕉+ 1.7 马铃薯的培养基 中， 每 5 o 0 mL兰花瓶注人培养基 1 5 0 m L 。接种后将瓶苗置 于温度( 2 7 2 ) 、 光照强度 10 O O 2 0 0 0 l x ( 每天连续 光照 1 0 h ) 、加设水帘风机系统 的环境下培养 。 3个月 后即可出瓶。“ 二步法” 对初期植入小苗的要求较低。淘 汰出变异株后 ，有根苗和无根苗均可植入，第 2次转接 时调整同瓶整齐度即可。相 比较而言，以“ 二步法” 的生根效果较好，但该方 法步骤多且较繁琐，生产成本高。2种方法瓶苗 出瓶后 大棚恢复的差异不显著 ，因此在大规模生产 中多选择 “ 一步法”，在材料充足的情况下往往将小苗 、弱苗淘汰。由于石斛兰原球茎细胞全能性很强，不添加激素也 可分化发育出正常的根、茎、叶，因此生根培养基可不 添加激素。五、石斛兰（移栽）炼苗生根培养 3个月后 的石斛兰 ，大 多已长 出 1 O条 根、5片叶和 1 个分蘖，叶片表面的角质层也 已形成，可有效抵抗低强度的光线照射及减少水分散失。出瓶 前不需开盖放置，小苗根部也不需浸泡消毒液， 将培养基除干净 即可直接出瓶种植。 新购 的水苔、穴盘和培 养杯用清水冲洗浸泡甩干即可，重复利用的材料必须 消毒后方可再用。 出瓶后 l 周内， 温室光照强度应控制 在 l0 0 O l x以内。必要时可于植株上方 l 2 m处加盖 1 层遮荫网： 相对湿度控制在 8 5 以上。每天喷雾 3 4 次可保证湿度。将组培所得的石斛兰苗移人温室，练苗 3d后移栽。移栽前先洗净组培苗根部培养基，用 5 O的多菌灵可湿性粉剂100 0 倍液浸泡 1 5min,然后移人苔藓基质中。其移栽成活率为 7 2。在石斛兰的组织培养过程中，会产生褐化。原因是由于植物离体组织或细胞中的多酚氧化酶被激活，和酚类物质氧化产生棕黄色的醌类物质，并抑制其他酶的活性，这些酚类物质慢慢扩散到培养基中去， 毒害外植体，严重影响离体培养植物组织的生长分化和再生，造成生长不良至死亡。因此，在石斛兰的组织培养过程中，要防止褐化现象的产生，该试验通过在培养基中加入0.5的活性碳，很好的解决了褐化问题，且发现加活性碳的培养基幼苗生长显著，根系发达，叶色浓绿。石斛兰组培苗移栽后 ，成活率偏低， 主要原因可能是缺乏共生菌。潘超美等 “从野生建兰和墨兰根中分离、 纯化培养收获 4种菌株，发现其真菌对诱导石斛组织培养物( 愈伤组织、 拟原球茎以及不定芽) 的生长均有不同程度的促进作用。郭顺星等从野生铁皮石斛和金钗石斛根中分离获得内生真菌 2 5种，其中 5种真菌可促进石斛种子萌发 ； 7种真菌可与石斛幼苗形成共生关系 。因此， 分离和筛选促进石斛兰生长发育的菌根真菌，可能是提高试管苗移栽成活率，解决北方石斛兰生产 的关键所在。石斛兰为世界四大热带兰之一，不同种或品种之间，其观赏价值可能有很大区别。离体扩繁技术为石斛种质资源有效的保存和持续利用提供了可能。参考文献：1 乔永旭、张永平石斛兰的组织培养J.安徽农业科学，2010（4）：1731-17342刘 金，兰花M.北京.中国出版社1998（6）3钟士传，植物激素对石斛兰组织培养效果的影响J，安徽农业科学，2005（4）：621-6294 王清莲，植物组织培养M，中国农业出版社，2004.（5）：31-405 王清莲，张宝红，刘方.一种适用于再生植株和转基因植株移栽的方法J.河南职技师院学报，1999（3）：27-286四川农业大学果树良种苗木脱毒研究中心.落叶果树病毒病及脱毒研究M .成都科技大学出版社，1998.1-2，69-707 张爱香，常美花，通过拟原球茎发生途径建立春石