HPLC法测定5个产地斑蝥药材中斑蝥素的含量.doc

HPLC法测定5个产地斑蝥药材中斑蝥素的含量【摘要】目的：测定不同产地斑蝥药材体内不同形态斑蝥素的含量。方法：运用高效液相色谱法测定5个产地斑蝥游离斑蝥素和总斑蝥素的含量。用氯仿提取游离斑蝥素，酸水解提取总斑蝥素。结果：加酸提取后斑蝥中斑蝥素含量显著升高;不同产地斑蝥药材中游离斑蝥素含量接近，平均含量为1.01%，总斑蝥素含量为游离斑蝥素的1.85倍。结论：酸水解处理后斑蝥素提取率升高，总斑蝥素更能反映药材毒效与质量。 【关键词】 斑蝥;游离斑蝥素;总斑蝥素;高效液相ABSTRACT Objective： To determine the contents of cantharidin in different existing forms of Mylabris from different areas. Methods： The total cantharidin obtained by acidolysis method and the free cantharidin obtained by direct extraction method were determined in Mylabris from five different areas by HPLC. Results： The content of cantharidin in Mylabris was increased significantly after extraction with acid. The contents of free cantharidin were similar in Mylabris from different producing areas， averaged as 1.01%. The content of total cantharidin was 1.85 times higher than the free one. Conclusions： The extraction rate of cantharidin increases after using the acidolysis method. Total cantharidin can reflect the toxicological effect and quality of Mylabris.KEY WORDS Mylabris; Free cantharidin;Total cantharidin; HPLC斑蝥(Mylabris)为芫菁科斑芫菁属昆虫南方大斑蝥Mylabris phalerata Pallas 或黄黑小斑蝥Mylabris cichorii Linnaeus 的干燥体。主产我国长江流域及以南各省区。药用始载于神农本草经，距今已有2000多年的应用历史，为中国药典常用有毒中药。性寒，味辛，有大毒，具有破血消癥、攻毒蚀疮、引赤发泡的功效1。近年来广泛用于肿瘤病、肝炎及皮肤病的治疗。斑蝥素(Cantharidin)既是其抗肿瘤、抗病毒有效成分，亦是其主要毒性成分。本文采用GC/MS法对不同产地南方大斑蝥水解产物进行了分析，表明不同产地斑蝥药材化学成分组成及其含量有较大差异，其主要成分斑蝥素含量高低相差3.79倍2,3。同剂量药材由于斑蝥素含量的差异可能导致临床疗效与毒性的不确定性，若使用不当易引起不良反应4。为了进一步确证不同产地斑蝥药材不同形态斑蝥素含量，指导临床安全用药，本研究以游离斑蝥素和总斑蝥素为指标，采用HPLC法对全国5个主要产地2种斑蝥药材进行了比较分析与评价。1仪器与试药1.1仪器Agilent 1200 高效液相色谱仪(DAD检测器)，AY220电子天平(日本SHIMADZU公司);Sartorius电子分析天平(赛多利斯科学仪器);离心机(上海兰科仪器有限公司);超声清洗器KQ-100(昆山市超声仪器有限公司);DK-S22型电热恒温水浴锅(上海精密实验设备有限公司)。1.2试药斑蝥素对照品(自制，纯度98% );斑蝥药材购自安徽铜陵中药饮片有限公司，产地为：广西、安徽、河南、湖南和湖北。净制处理后按品种分类，经陈建伟教授鉴定为南方大斑蝥Mylabris phalerata Pallas和黄黑小斑蝥Mylabris cichorii Linnaeus的干燥体;甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。2方法与结果2.1色谱条件C18柱(4.6 mm×250mm,5 μm);流动相为甲醇：水(3070);检测波长：230 nm;流速：1.0 mL?min-1;柱温：30 ;进样量：10 μL;在此条件下，样品中斑蝥素峰与杂质峰的分离良好。见图1,2。图1斑蝥素对照品HPLC图谱图2斑蝥药材HPLC图谱2.2对照品溶液的制备取斑蝥素对照品，加甲醇制成每1 mL含2.031 mg的溶液，作为对照品溶液。2.3供试品溶液的制备取斑蝥虫体，于50 干燥6 h，粉碎，过60目筛，于干燥器中保存备用。本实验采用2种方法制备样品，以分别测定总斑蝥素和游离斑蝥素的含量。2.3.1游离斑蝥素的提取取药材粗粉1 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，加氯仿30 mL,70 水浴回流提取1 h，过滤，少量氯仿洗涤容器，合并滤液于70 水浴挥干，残渣加甲醇溶解，定容至10 mL，摇匀，即得。2.3.2总斑蝥素的提取取药材粗粉0.5 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，加氯仿15 mL，HCl(pH=1)10 mL,70 水浴回流提取1 h，过滤，少量氯仿洗涤容器，滤液转移至分液漏斗中，静置，分取下层氯仿层，70 水浴挥干，残渣加甲醇溶解，定容至10 mL，摇匀，即得。2.4线性关系考察取2.2对照品溶液，精密量取0.2,0.4,0.8,1.2,1.6,2 mL加甲醇定容至2 mL，按照上述色谱条件，重复进样2次，每次10 μL，测定峰面积，以峰面积平均值和浓度进行回归处理，得回归方程：Y= 524.44X- 3.3499，r=0.999 9。结果表明，斑蝥素在0.20312.031 mg?mL-1范围内线性良好。2.5精密度实验取每1 mL含斑蝥素2.031 mg的对照品溶液，连续进样6次，每次进样10 μL，测定斑蝥素峰面积，RSD=0.26%。2.6稳定性实验取河南黄黑小斑蝥药材粉末，按2.3项下方法制备供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、12 h各进样一次，每次进样10 μL，测定斑蝥素峰面积，游离斑蝥素RSD=1.28%，总斑蝥素RSD=1.35%。2.7重复性实验取河南黄黑小斑蝥药材粉末各6份，按2.3项下方法制备供试品溶液，测定游离斑蝥素平均含量为1.02%，RSD=2.73%;总斑蝥素平均含量为1.88%，RSD=2.80%。2.8加样回收实验海南医学院学报 Vol.17 No.5 May.2011分别取河南黄黑小斑蝥药材粉末0.5g,0.25 g各6份，精密称定，精密加入对照品溶液，按2.3项下方法制备供试品溶液，分别注入液相色谱仪测定，计算回收率，结果见表1、2。表1游离斑蝥素加样回收试验测定结果表2总斑蝥素加样回收试验测定结果2.9样品的测定结果取5个产地的斑蝥药材粉末，精密称定，分别按2.3项下方法制备供试品溶液。并按上述方法测定其中游离斑蝥素和总斑蝥素的含量，结果见表3、4。表3南方大斑蝥中斑蝥素含量测定结果表4黄黑小斑蝥中斑蝥素含量测定结果3讨论3.1提取溶剂的选择提取斑蝥素常用溶剂有：丙酮、氯仿、乙醇5,6。考虑到用丙酮和乙醇提取总斑蝥素时，须再用溶剂萃取或过柱处理。而用氯仿提取，上层酸水解，下层提取，直接分取氯仿层即可，操作简便。3.2提取方法的选择提取游离斑蝥素时，比较了回流、超声、冷浸的提取效果，结果表明，回流提取效果最好;提取总斑蝥素时，考察了pH、HCl用量对提取效果的影响，结果表明，用pH=1的HCl 10 mL提取效果最好。本研究结果表明，不同产地斑蝥药材中游离斑蝥素含量接近，平均含量为1.01%;总斑蝥素含量差异较大，其中安徽产黄黑小斑蝥含量较高(2.53%)，湖北产南方大斑蝥含量最低(1.49 %);相同产地大、小两个品种间比较，游离斑蝥素含量相近，总斑蝥素含量差异较大。酸水解处理后得到的斑蝥素平均含量为1.87%，为直接提取所得含量的1.85倍，大大高于药典规定的0.35%。若斑蝥粉末药材进入体内，在胃液(pH 12)强酸环境下，结合斑蝥素易发生酸水解， 释放斑蝥素，使实际入血的斑蝥素浓度增加，易引发用药安全问题7。因此，为了能更准确的反映斑蝥药材内在毒效与质量，建议临床用斑蝥每批斑蝥药材应标注总斑蝥素和游离斑蝥素含量。【参考文献】 1国家药典委员会编.中华人民共和国药典(2010年版一部)S.北京：中国医药科技出版社，2010：311-312.2张建辉，陈建伟，武露凌，等.南方大斑蝥丙酮提取物成分的GC/MS分析J.中国药房，2009,20(30)：2363-2365.3张建辉，陈建伟，李祥，等.不同产地南方大斑蝥水解产物化学成分的比较分析J.天然产物研究与开发，2009,21(3)：449-452.4进权，王宁生. 斑蝥的毒性反应及原因分析J. 新中医，2003,35(7)：76-77.5罗晶，奚耕思. 斑蝥素的提取应用及研究进展J. 中国药房，2007,18(27)：2140-2142.6李清，贾