食品中的多酚氧化酶.doc

食品中的多酚氧化酶中国食品产业网 （2007年3月3日11:27）多酚氧化酶(P01yphenol Oxidase，PP0)是自然界分布极广的一种氧化还原酶，茶叶中的多酚氧化酶通过控制不同的酶活可以加工成品质与滋味迥异的各类茶叶。自1883年Yoghid发现日本漆树液汁变硬可能和某种活性物质相关，1938年KeilinD和MannG研究了蘑菇多酚氧化酶的提取和纯化，得到多酚氧化酶并将这类酶称为p01yphenol Oxidase。之后多酚氧化酶一直是研究的热点，尤其是在PP0的生化、生理学性质方面取得了较大的进展。氧化还原酶(1)酚酶 又称多酚氧化酶、酪氨酸酶、多酚酶、儿茶酚氧化酶、甲酚酶、儿茶酚酶。最适 pH为57，可以催化酚类物质氧化。酚酶在植物界中存在广泛，是许多蔬菜、水果的切面在空气中迅速变黑的主要原因。1、 多酚氧化酶的分布与在植物中的作用PP0是核编码的的铜金属酶，是在细胞质中合成的，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，PP0相当稳定，甚至在土壤中已腐烂的的植物残渣上都可检测到PP0的活性。在植物(如土豆、苹果、荔枝、菠菜、马铃薯、豆类、茶叶、烟草等)组织中，PP0是与内囊体膜结合在一起的，天然状态无活性，但将组织匀浆或损伤后酶活被活化，从而表现出活性，在果蔬细胞组织中，PP0存在的位置因原料的种类、品种及成熟度的不同而有差异，绿叶中PP0活性大部分存在于叶绿体内；马铃薯块茎中几乎所有的亚细胞部分都含有PP0，含量大约与蛋白质部分相同，马铃薯芽、根的多酚氧化酶的活性最高，幼叶和成熟块茎中活性中等，成熟叶和茎叶活性最低；在茶叶中的PPo可分为游离态和束缚态，前者主要存在于细胞液中属可溶态PP0，而后者则主要存在于叶绿体、线粒体等细胞器中，与这些细胞器的膜系统或其他特异部位结合呈不溶态，StePhenThanarajS.N. (1990)研究了茶树新稍中PP0活性及多酚含量对红茶品质的影响，发现PP0活性强，多酚含量高，对红茶品质有利，相反则利于绿茶的生产。在采摘的鲜苹果中，PP0几乎存在叶绿体和线粒体中，从这两部分分别制备的PP0，其底物专一性稍有差异。刘乾刚认为，PP0在细胞内除了存在于叶绿体及线粒体上外，细胞壁也可能存在PP0，且对发酵产生影响，细胞只要轻微破损便有PP0的作用。在动物中(如鼠、免)，PP0也得到了分离。多酚氧化酶是一种质体酶，有些研究人员认为多酚氧化酶可能仅存在于质体中，缺乏质体的组织就不存在多酚氧化酶，例如筛管和筛胞等，但是有质体的组织也可能没有多酚氧化酶，如C4植物叶。含有质体的植物组织不一定都存在多酚氧化酶，而多酚氧化酶一定在含有质体的植物组织中。虽然从1895年就开始了多酚氧化酶的研究报道，但其在植物组织中的功能并未充分了解，随分子生物学的发展，象西红柿、苹果等的多酚氧化酶的基因已被克隆。浙江大学赵东等对茶树多酚氧化酶的克隆及其序列进行了比较。从已经克隆的多酚氧化酶的基因看，均属于基因家族，多则67个基因。这些基因的表达具有时空差异和组织特异性(PP0在幼龄组织中表达，在成熟组织中不表达)，表明了植物中所起的作用不同。但在高等植物组织发生褐变主要是PP0活动的结果。2、果实中多酚氧化酶的作用条件果实在树上生长时不会发生褐变，褐变发生在果实采后贮藏过程中，而且随贮藏时间的延长褐变加重，说明褐变与果实成熟衰老有关。采收期的早晚对酶促褐变的影响可能是组织衰老和自身保护酶系。 不同产地果实的褐变程度也不同，说明褐变与果树的栽培管理和果实的营养水平有一定关系。不同大小的果实在储藏过程中的褐变程度不同，一般大果实比小果实易发生褐变，原因可能与果实储藏后期果心释放出来的CO2不能及时排出有关。统互相作用的结果。3、果实中与褐变有关的酶及特点国内外的研究一致认为果实中的PPO是果实发生酶促褐变的主要酶。PPO是一种含铜酶，能催化两类不同的反应，可以使一元酚羟基化，生成相应的邻二经基化合物；也可以氧化邻苯二酚生成醌。对PPO进行分离纯化鉴定，认为PPO有几种不同的存在形式，最重要的是相对分子质量为64000的一种。PPO与果实褐变有密切的关系，在苹果开花后的45个月内，蛋白质中PPO的含量保持不变，但PPO的活性降低了，在末成熟的果实中，有活性的PPO大多存在于果心部位，果心处的PPO活性最高，其次是果肉，最后是果皮，这与果实从果心向果皮的褐变过程吻合。对PPO的进一步研究发现PPO有同工酶存在，依据是在不同PH系列下PPO的活性出现两个以上的峰。对分离的PPO同工酶性质进行分析，发现同工酶间的性质差别较大。关于PPO活性最适宜的PH，研究结果存在争议，有人认为pH 3.8最适宜，也有人认为pH 6.2：或pH5.6最适宜。对PPO热稳定性的研究结果比较一致，在60以上仍有部分活性。根据这一特性，陈秀芳等认为桃加工后期发生的褐变，不完全是非酶褐变,也可能有酶促褐变的参与。3、 果实中PPO的底物PPO的底物是酚类物质，果实中的酚类物质很多，酚类物质的种类和含量在果实生长和成熟过程中会发生变化，在果实贮藏过程中随贮藏时间的延长含量下降，同时随果实酚类物质含量的下降，PPO活性增加，褐变增加。一般认为果实在储藏期间酚类物质含量的下降是被PPO氧化的结果。PPO对邻经基结构作用最强，同时取代基团的取代位置也影响酶与底物的结合能力。总之，不同种类的果实PPO的底物可能不同，同一类果实在不同的生长发育阶段，PPO底物也可能不同。研究PPO主要底物应以该底物含量在褐变前后发生变化的程度为主要依据。4、褐变与果实成熟衰老的关系随着果实贮藏时间的延长，果实内部发生了一系列的生理生化变化，表现为果胶物质的分解，有机酸的下降，呼吸增加，乙烯释放增加，总的趋势是趋于衰老。果实在贮藏过程中发生酶促褐变的根本原因与果实衰老有关，吴民江等对苹果梨贮藏过程中果皮褐变进行了研究，发现在贮藏过程中果皮酚类物质含量降低，褐变加深，他们认为，果皮失水及膜脂氧化作用导致组织膜透性增大、区域比分布破坏是褐变反应的重要原因。一般认为，细胞内酶与底物是分区定位的，正常的生活细胞具有完整的超微结构，能保证各种生理生化反应正常进行。酚类物质主要存在于液泡中，PPO主要存在于细胞质中，在细胞结构正常时二者不能互相接触，不会发生酶促褐变；当组织衰老时，由于膜系统的破坏导致组织结构和细胞空间区划丧失，使原来酶与底物的分区定位遭到破坏，从而酶与底物接触，诱发了酶促褐变。5、 多酚氧化酶的提取方法及活性测定多酚氧化酶是一种重要的末端氧化酶，不管是对其进行性质、同工酶、活性以及影响因子的研究，还是对生理功能、基因克隆等方面的研究，都需要把多酚氧化酶从物体中分离纯化出来。19111912年间Bemald和Welter沿用Marn的酶提取方法(鲜叶加兽皮粉捣碎，再以酒精沉淀，最后得到的白色干燥粉，即为酶制剂)，早期分离得到的酶大多数是不溶性，活力很低。后来学者在提取介质中加人多酚吸附剂，才分离出可溶的多酚氧化酶，即首次将PolycarAT(PVP)用于茶叶酶学研究，并指出高效多酚吸附剂，如PVP的使用对任何富含多酚的植物酶学都是有必要的。C08Ron等(1993)采用液氮低温冷冻提取介质的PH7.0，加人吐温80或葡聚糖凝胶G50，该改良方法可获得活力较高的可溶性多酚氧化酶。在苹果研究中，发现品种不同，酶活亦不同，为了有效的控制酶促褐变，有学者利用乳化剂(Triton X100)和酚结合剂聚乙烯毗咯烷酮(PVPP)相结合的方式提取PP0酶，从而解决了单纯用丙酮粉法预处理而导致的酶特性的改变。在一般材料中的PP0酶的研究多采用丙酮粉法和缓冲液匀浆法。如有的学者进行小麦活性检测采用的是缓冲液匀浆法，而在枣果实多酚氧化酶性质的研究中有的学者，则采用的是丙酮粉法。综上所述，多酚氧化酶一般采用如下几种提取方法：(1)、丙酮粉法(常规法)；（2）、匀浆法；（3）、匀浆浸提法。在这些方法中，有实验者表明丙酮粉法对PP0酶提取活性损失较大，活性得率较低，但其酶粉活性尚可、体积小和便于贮存，可直接应用；缓冲液匀浆液提取活性得率较高，但酶液本身活性较高，不利于酶的应用，尚需进行浓缩、提纯才能达到应用的要求。另据报道采用匀浆法和丙酮粉法二者结合的方法，是一种很好的提酶方法。多酚氧化酶活性的测定方法一般是：（1）、检压法就是在一定的温度、PH值和基质浓度下，多酚氧化酶氧化基质的速率与单位酶浓度和单位时间内的耗氧量成正比。因此用瓦氏呼吸计测定耗氧率知多酚氧化酶活性的高低。（2）、氧电极法主要是利用氧电极测定反应中的耗氧量来表示酶活力，例如可以用来测小麦的酶活。（3）、比色法主要是多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化生成有色产物，单位时间内有色产物在460nm处的光密度与酶活性强弱成正比。（4）、碘量滴定法。其中比色法操作简便，结果较准确，目前最常用。6、 多酚氧化酶贮藏过程中的酶活变化多酚氧化酶在氧气存在的条件下，催化各种酚类(单宁、儿茶酸、黄酮、一元酚等)使之氧化成酮，再进一步氧化聚合成黑色素。近几十年来，国内外对植物组织的褐变进行研究的结果一致表明，组织的褐变现象主要是多酚氧化酶作用于天然底物酚类物质所致。不少学者对果蔬加工和贮藏进行多酚氧化酶的活性变化研究。因为果蔬在采摘后仍然进行着一系列的生化反应，果蔬中贮存的物质逐渐被水解，并以酶系的催化反应为主要特征，从而会出现色变，影响品质。有的学者研究了苹果材料在不同贮藏期后，PP0活性随贮期延长而下降，PP0在果实采收时保持有较高活性，而随着贮期延长，果实中的生化反应加强，从而活性发生了变化。关于枣果实采后贮存中PP0的活性变化，冠小红(2000)认为呈上升趋势。但关于丙酮粉提取的多酚氧化酶活性变化到目前为止末见到相关的报道。多酚氧化酶活性对茶叶的品质影响较大，并且不同类型的茶叶要求不同活性的多酚氧化酶，红茶中要求较高的酶活，使多酚氧化酶氧化生成红茶中特有的色泽和香味。而绿茶则要求较低的酶活性，减少多酚类的氧化，以保持茶叶的绿色和鲜爽的特点。一些学者对于茶叶中多酚氧化酶活性变化主要着重缓冲液浸提与否，何种提取方法(因为对于酶活的高低，受到提取方法等外在条件的影响)和萎凋轻重问题等。在1998年刘仲华研究表明，用丙酮粉提取的酶浸提与不浸提相比，酶活有很大的不同，浸提12h，酶活力几乎高一倍。但对于茶鲜叶和丙酮粉提取贮藏中活性变化未见到相关报道。7、 多酚氧化酶的同工酶同工酶在植物体内广泛存在，植物中研究较多的同工酶有过氧化物酶(POP)，多酚氧化酶(PP0)的同工酶。茶PP0同工酶的研究最早是60年代初，19631966年，Bendall和Gregorg分离了5种同工酶，1971年Pruidze等人分离出6种同工酶，1974年Buz抓等人测定了这6种同工酶的分子量，近年的实验结果表明PP0的酶谱中，多的可达10条。酶是基因表达的产物，而同工酶是其有相同功能而结构和性质不同的酶分子，它的合成主要受遗传基因的控制，具有一定的稳定性。PP0同工酶的分离一般采用聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(垂直平板电泳)和圆盘电泳。同工酶分析已广泛应用于植物种质资源、遗传育种、生理代谢、个体发育及适应不良环境变化等研究领域。近年来，有关农作物、果树及其它木本植物POD和PP0的同工酶研究已有不少报道，POD和PP0是同工酶分析中常用的酶，它们与植物生长发育过程密切相关，因此可反映出植物体生长发育过程中基因的存在和表达情况，且POD和PP0能将植物体内某些有害的代谢副产物转变为无害物质，从而对植物的生长、发育和提高抗性起积极作用。同工酶技术是研究物种分类以及确定物种亲缘的一种重要而有效的手段，国内外学者利用同工酶技术对茶叶加工过程中的生化成分变化，品种间亲缘关系分析等方面都做了大量工作，现在我国科研人员还通过研究同工酶，探讨茶树的起源，品种的早期鉴定，加工中同工酶的变化对品质的影响等问题。8、 影响酶活的因素主要有pH、作用温度、底物浓度、酶液自身的浓度以及作用时间。由于食品种类的不同，各种因素的影响也有较大差异。9、多酚氧化酶的应用PP0与抗病性的关系人们已进行了广泛的研究。植物在抵御病原微生物的侵染过程中，抗性相关酶发挥了重要作用，这主要包括了酚类代谢系统中的一些酶和病原相关蛋白家族PP0通过催化木质素及酮类化合物形成，构成保护性屏蔽而使细胞免受病菌的侵害，也可以通过形成酮类物质直接发挥抗病作用。目前，有关抗性相关酶在植物感病的过程中的变化情况已有大量报道，如利用番茄、黄瓜等植株作为试材，考察相关病后菌侵染对PP0、POD和pAL高抗性相关酶的活性都会提高，这3种酶与植物抗性的获得呈现明显的相关性。PP0催化酚类化合物形成的酮类化合物具有更大的毒性，有关多酚氧化酶及其同工酶与植物抗病虫等抗性关系的研究已有报道。PP0是黑色素生物合成过程中的主要限速酶。大多数皮肤病脱色剂都是通过抑制该酶活性来阻断皮肤黑色素生成。从植物药中分离天然的活性成分日益受到人们的关注，不但在临床用于黄褐斑、雀斑等色素增加性皮肤病的治疗，而且还作为用于美容化妆品。污水中酚的检测，由于方法，仪器昂贵等方面的原因，不便现场测试，有的学者通过研究生物传感器PP0传感器测定酚类化合物，简单，且有一定的灵敏度和准确度。在昆虫体内，PP0参与外甲的硬化及起自身的保护作用。多酚氧化酶的作用主要是促使儿茶素类物质氧化形成茶黄素、茶红素和其它