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文档简介

实验原理 聚合酶链反应 PCR PCR技术的基本原理 利用DNA聚合酶 依赖DNA模板的特性 模仿体内的复制过程 在附加的一对引物之间引发的聚合酶链反应 PCR反应的基本成分 模板DNA 待扩增DNA 引物4种脱氧核苷酸DNA聚合酶适宜的缓冲溶液 PCR引物 引物是人工合成的短DNA片断 它们与所要扩增的DNA片断的起始和终止区域完全互补 在 黏合 时引物结合于DNA模板的起始和终止点 DNA聚合酶结合到这两个位置 开始合成新的DNA链 作用 引物决定了需要扩增的起始和终止位置 PCR反应的基本成分 模板DNA 待扩增DNA 引物4种脱氧核苷酸DNA聚合酶适宜的缓冲溶液 脱氧单核苷酸 dNTP 作用 用于构造新的互补链 PCR反应的基本成分 模板DNA 待扩增DNA 引物4种脱氧核苷酸DNA聚合酶适宜的缓冲溶液 DNA聚合酶 TaqDNA聚合酶 特性 1 具有95 以上的耐热性 2 Mg2 依赖性酶作用 催化转录 PCR反应的基本成分 模板DNA 待扩增DNA 引物4种脱氧核苷酸DNA聚合酶适宜的缓冲溶液 适宜的缓冲溶液 成分 50mmol LKCl 10mmol LTRIS Cl 1 5mmol LMgCl2 100 g ml明胶 0 25 mol L的引物 200 mol LdNTP 25U的Taq酶和DNA样品作用 提供适合聚合酶行使功能的化学环境 基本成分 模板DNA 待扩增DNA 引物4种脱氧核苷酸DNA聚合酶适宜的缓冲溶液 作用 含有需要扩增的DNA片断决定了需要扩增的起始和终止位置用于构造新的互补链 复制需要扩增的区域 提供适合聚合酶行使功能的化学环境 小结 PCR的反应条件 反应条件 温度 时间和循环次数温度 双链DNA在90 95 变性 再迅速冷却至40 60 引物退火并结合到靶序列上 然后快速升温至70 75 在TaqDNA聚合酶的作用下 使引物链沿模板延伸 循环次数 循环次数决定PCR扩增程度 PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度 一般的循环次数选在30 40次之间 循环次数越多 非特异性产物的量亦随之增多 PCR的反应动力学 Y 1 X nY DNA片段扩增后的拷贝数X 平均每次的扩增率n 循环次数 体外PCR扩增和体内DNA复制 PCR单链多态性分析 单链构像多态性 SSCP 是指单链DNA在溶液中形成立体构象 等长的DNA片段因其序列中核苷酸的组成和排列顺序不同 形成的构像不同 在非变性PAGE时表现为电泳速度的差别 PCR SS
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