神经病理性疼痛大鼠行为学及生长相关蛋白表达的变化.doc

神经病理性疼痛大鼠行为学及生长相关蛋白表达的变化厉彩霞 林海 王均炉温州医学院附属第一医院麻醉科摘要 目的：观察大鼠坐骨神经结扎后神经病理性疼痛行为学以及生长相关蛋白-43(GAP-43)表达的变化。方法：采用坐骨神经结扎损伤（CCI）模型，75只SD大鼠，随机分为三组（n=25）。对照组（con组）：不接受任何手术操作；假手术组（sham组）：只分离坐骨神经，不予以结扎；CCI组：结扎坐骨神经。于术前2d，术后1、3、5、7、10、14、21、28d测定各组大鼠热缩足反射潜伏期（TWL），机械缩足反应阈值（MWT），并于术后3、7、14、21、28天各组随机抽取5只大鼠杀死，采用免疫组织化学方法测定脊髓背根节GAP-43表达的变化。结果：与sham组和比较，CCI组术后各日TWL，MWT明显降低(P0.01或0.05)。CCI组较其它组GAP-43表达增高，且此蛋白在CCI组中术后第三天表达开始增高，第七至十四天达最高峰，以后逐渐下降。结论：CCI造模成功后大鼠痛觉及机械痛觉均过敏，且GAP-43表达增高。关键词 神经病理性疼痛 行为学改变 GAP-43Behaviorl observation and changes of the expression of growth associated protein-43 in dorsal root ganglion of rats following ligaion of sciatic nerve Li cai-xia, Lin-hai, Wang jun-lu Department of Anesthesiology,First Affiliated Hospital,Wenzhou Medical College,Wenzhou 325000,ChinaAbstract Objective To investigate the behaviorl observation and changes of growth associated protein-43 in dorsal root ganglion of rats with ligaion of sciatic nerve.Methods Seventy-five SD rats were randomly divided into 3 groups :Control group(Con),Sham operation group (Sham),Chronic constriction injury group(CCI).CCI model was adopted ,thermal withdrawal latency (TWL) and mechanical withdrawal threshold (MWT) of rats were measured on1,2 pre-operative and 1,3,5,7,10,14,21,28 post-operative days.Five rats were randomly picked from each group on 3,7,14,21,28 post-operative days and the immunochemistry was adopted to detect the change of GAP-43 expression on spinal dorsalhom .Results TWL and MWT in CCI were significant lower than Sham group on every post-operative day (P0.01or0.05).The expression of GAP-43 was higher in CCI than other groups,and in this group the expression of GAP-43 was increased in the third day ,from the seventh day to the fourth day the expression arrived to the highest,then it began to decline.Conclusion The success of CCI appeared rats thermal and mechanical hyperalgesia and the expression of GAP-43 was increased.Key words Neuropathic pain; Change of behavior; GAP-43神经系统物理损伤、代谢异常、缺血、病毒感染引起神经病理性疼痛，其特征为自发痛、触诱发痛及痛觉过敏。它是人类较常见的疼痛性疾病，但其发病机制复杂而使临床缺乏有效的治疗手段。神经病理性疼痛机制存在多种学说,其中以中枢敏化学说研究较多,张德仁等1研究认为GAP-43可以阻断神经病理性疼痛中枢敏化的形成，且刘光久等2在大鼠的坐骨神经再生的研究中发现，当轴索受 通讯作者损后脊髓前角运动神经元出现快速的应激反应，即胞体中GAP-43mRNA在术后表达增高。神经受损后，GAP-43蛋白合成增加并沿轴突运输至生长锥，促进神经再生及神经突触连接重建，此外，GAP-43与突触可塑性关系密切,研究表明神经损伤后引起的疼痛也与GAP-43的表达有关3。因此通过对慢性坐骨神经损伤CCI模型大鼠的行为学及生长相关蛋白改变的研究可以探讨神经病理性疼痛的可能发病机制，从而为神经病理性疼痛的发病机制和临床上的治疗提供理论依据。材料与方法1、 动物、试剂与仪器健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠75只，体重220-250g,由温州医学院实验动物中心提供。戌巴比妥钠购自国药集团试剂有限公司。336爪/尾刺激痛觉测试计以及2390Electrovonfrey测痛计购自美国TC公司。一抗小鼠抗大鼠生长相关蛋白(growth associated protein-43,GAP-43,Sc-17790)试剂购自Santa cruz biotechnology inc,f二抗山羊抗小鼠试剂购自Proteintech Group Inc ,HMIAS-2000型全自动医学彩色图像分析系I统。2、动物分组及实验 SD大鼠随机分为3 组：（1）对照组（con组）：不接受任何手术操作；（2）假手术组（sham组）：只分离坐骨神经，不结扎；（3）CCI组：结扎坐骨神经。参照Bennett和Xie4描述的方法制作CCI模型，切开皮肤，分离坐骨神经，以4号铬制线结扎4道，每道间隔约1mm。sham组步骤与CCI组相同，但仅暴露神经而不加结扎。术后单笼饲养。 3、 行为学测定 分别于术前第1、2d及术后1、3、5、7、10、14、21、28d测定，测定时间恒定于每日10：00-14：00，室温维持240.5。 （1）热缩足反射潜伏期（thermal withdrawal latency,TWL）的测定：采用336爪/尾刺激痛觉测试计测定大鼠TWL。参数设定：加热头空闲时激光发射强度为20%；加热头测试工作时激光发射强度为60%；切断时间30s,将实验大鼠置于透明玻璃板上，照射大鼠双侧后足足底，足底出现抬腿回避时间为TWL。每次刺激间隔5min，测3次取平均值。（2）机械缩足反射阈值（mechanical withdrawal threshold,MWL）的测定：置大鼠于透明的有机玻璃箱中，底为11cm2的铁丝网，实验前使之适应15min。采用2390Electrovonfrey 测痛计，由下往上垂直刺激大鼠足底皮肤，逐渐加大刺激强度，观测回缩反应（如舔足、甩腿等）时的刺激强度值为MWT，每次刺激间隔10s,测5次取平均值。4、取材、组织制备及免疫组织染色 到达实验存活期的大鼠，腹腔注射1%的苯巴比妥钠40mg/kg,深麻醉后，开胸经升主动脉灌注固定。先用100ml%肝素0.9%NaCL溶液快速冲洗血液，再用4%的多聚甲醛的磷酸缓冲液(PH=7.4)固定.取出与坐骨神经相连的背根神经节(L5、L6)。在上述甲醛溶液中固定4-6h常规石蜡包埋，将组织块连续切片，每一组织各取5张片，按GAP-43试剂说明书行免疫组织化学染色。采用两步法，切片常规脱蜡至水，TBS盐缓冲液洗4-5 次，高压修复十分钟，依次滴加RegentF与B各孵育半小时，加一抗4过夜。用TBST冲洗4-5次，滴加RegentC，室温孵育一小时，再用TBST冲洗4-5次加RegentD室温孵育半小时。再加E1、E2、E3混合物，显微镜下观察控制显色，流水冲洗终止显色。苏木精轻度复染，脱水，透明，中性树脂封固。显微镜观察。阳性细胞胞浆着色为棕黄色。对照实验用TBS替代一抗行免疫组化染色，结果为阴性。5、统计学分析 全部数据以均数标准差（xs）表示，组间比较用单因素方差分析，继以最小显著法（LSD）行两两比较。用SPSS12.0统计软件包进行数据处理，P0.05为差异有统计学意义。 结果1、各组间TWL、MWT基础值差异无显著性（P0.05）,所有动物术后均未见肢体运动障碍和自残现象。2、CCI后TWL的变化 Con组及Sham组各时间点的TWL变化差异无显著性（P0.05）。CCI组TWL从术后第1日开始下降，第5日降至最低值（为基础值的47.9%,与基础值比较P0.01）,以后缓慢回升，但直至第28日仍低于基础值。与Sham和Con组比较均显著下降，差异有统计学意义。（见图1）。(xs,n=5)*P0.05,*P0.05）。CCI组MWT从术后第1日开始降低，并稳定维持28日以上，术后各日MWT均较基础值显著降低（P0.01）(见图2)。(xs,n=5)*P0.05,*P0.01与Con和Sham组比较4、各组GAP-43表达的变化 棕黄色颗粒为阳性表达产物。假手术组与对照组GAP-43只有少量表达,手术组随时间的变化而出现GAP-43表达的。图象分析显示GAP-43灰度值（见表1)。表1、GAP-43灰度值分组Group假手术组Sham group对照组Contol group手术组Chronic constriction injury group3天7天14天21天28天灰度值Graylevel159.675.34160.836.01167.430.56*178.350. 69*179.280. 53*171.480.37*169.780.57*与假手术组、对照组比手术组P0.01 *与假手术组、对照组比手术组P0.05 图1对照组:散在阳性GAP-43表达 图 2假手术组: 散在阳性GAP-43表达Fig 1.Contol group : a little of positive Fig 1. Sham group : a little of positiveGAP-43 expression neurons GAP-43 expression neurons 图 3.用TBS代表一抗:无GAP-43阳性表达 图 4.术后三天组中等量GAP-43阳性表达Fign 3. no GAP-43 expression neurons Fign 4. a mediumt GAP-43 expression neurons 图 5.术后七天组 大量GAP-43阳性表达 图6.术后十四天组大量GAP-43阳性Fign 5.a lot of GAP-43 expression neurons Fign 6a lot of GAP-43 expression neurons 图7.术后二十一天组中等量GAP-43阳性表达 图8术后二十八天组中等量GAP-43阳性表 Fign7.a mediumt of GAP-43 expression Fign8.a mediumt of GAP-43 expression Neuro Neuro 讨论大鼠坐骨神经结扎疼痛是神经病理性疼痛和炎症性疼痛的结合，是由于轴突引起的异位放电和结扎处炎症细胞释放的炎症介质刺激产生的异位敏感性提高所致，该疼痛与人体外周神经损伤诱发的神经病理性慢性疼痛症状相似。本实验表明大鼠坐骨神经结扎后术侧足对热和机械刺激产生了明显的疼痛反应，与文献报道相似5，说明本实验模型制作成功。实验中观察到CCI组术后1dTWL已明显下降，术后5日发展为热痛敏高峰期，此后继续保持痛敏状态。生长相关蛋白（growth associated protein-43,GAP-43）是一种胞膜磷酸蛋白质,是神经系统发育和轴突损伤后再生、修复的内在决定因子6。在本实验中GAP-43在术后第三天出现表达增高，七至十四天表达达最高峰，以后又逐渐下降，这与Richard7等的研究结果一致。因为在周围神经再生过程中，周围感觉神经元将GAP-43转运至周围神经和脊髓背角中。转运至背根节引起新生生长锥的脊髓背角中GAP-43的高度表达，这种转运的结果引起背根节中GAP-43的高表达，在脊髓损伤中，GAP-43在新生的生长锥的背根节中高表达，且这种转运模式被中枢投射系统得以识别。这结果并不总是有益的，因为纤维在传送这些来自突触的触觉信息时将产生疼痛的感觉，可能是周围神经损伤时引起神经病理性疼痛的可能机制之一。8 另外，也有人认为疼痛的产生与中枢敏化有关,外周神经损伤引起脊髓背角神经元敏化和随之而来的脊髓兴奋性增高,这种现象称中枢敏化。脊髓背角C纤维诱发电位的LTP（long term potentiation）是初级传入C纤维与脊髓背角板层神经元之间的兴奋性突触传递效率增强的表现,被认为是中枢敏感化的基础。中枢敏化的特点是存在上扬(wind-up)现象和LTP；这样短暂的刺激可引起突触后电位的长时间的增加。Hulo9等指出磷酸化GAP-43的过度表达引起LTP电生理记录发现,在高频刺激下成对脉冲易化作用及对刺激反应的总和作用均增强。外周损伤引起脊髓背角神经元产生LTP，是产生痛敏的重要原因。同样Benowitz4研究表明GAP-43表达增加，可以通过异常纤维发芽而引起周围神经损伤病人的痛觉过敏和异常疼痛现象，这可能是神经源性疼痛的发病机制。所有这些均表明GAP-43与神经病理性疼痛关系密切,再加上本实验的结果我们认为GAP-43可能参与神经病理性疼痛的发病机制之一。因此，通过本实验在CCI模型中出现的GAP-43表达水平的变化，我们认为它可能参与神经病理性疼痛的中枢敏化机制，这样对神经病理性疼痛的发病机制有了进一步的认识，从而为临床上此类疾病的治疗提供了新的思路。因为，我们可以通过对GAP-43表达的干预来治疗神经病理性疼痛。 参考文献1、罗裕辉，张德仁：氯胺酮对神经病理性疼痛脊髓背角生长相关蛋白表达的影响。中国疼痛医学杂志。2007，13（3）157-1602、刘光久、李振强等 神经损伤与再生中神经元GAP-43MRNA表达的原位杂交研究J解剖学报，2002，33（6）：659-6613、Schreyer DJ,Skene JH.Injury-associated induction of GAP-43.expression displays axon branch specificity in rat dorsal root ganglion neurons.J Neurobiol,1993;24:959-9704、Bennett GJ, Xie YK.A peripheral mononeuropathy in rat that produces disordersof pain sensation like those seen in man .Pain ,1998,33(1):87-1075、Wang ZB,Gan Q,Rupert RL,et al.Thiamine,pyridoxine,cyanocobalamin and their