探针标记.doc

核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。 地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。第四节非放射性标记的核酸探针放射性标记核酸探针在使用中的限制，促使非放射性标记核酸探针的研制迅速发展，在许多方面已代替放射性标记，推动分子杂交技术的广泛应用。目前已形成两大类非放射标记核酸技术，即酶促反应标记法和化学修饰标记法。酶促反应标记探针是用缺口平移法，随机引物法或末端加尾法等把修饰的核苷酸如生物素-11-dUTP掺入到探针DNA中，制成标记探针，敏感度高于化学修饰法，但操作程序复杂，产量低，成本高。化学修饰法是将不同标记物用化学方法连接到DNA分子上，方法简单，成本低，适用于大量制备（50g）如光敏生物素标记核酸方法，不需昂贵的酶，只在光照1020min，生物素就结合在DNA或RNA分子上。非放射性标记核酸探针方法很多，现介绍常用的几种方法如下：一、生物素标记核酸探针方法生物素标记的核苷酸是最广泛使用的一种，如生物素-11-dUTP，可用缺口平移或末端加尾标记法。实验发现生物素可共价连接在嘧啶环的5位上，合成TTP或UTP的类似物。在离体条件下，这种生物素化dUTP可作为大肠杆菌多聚酶I（DNA酶I）的底物掺入带有缺口的DNA或RNA，得到生物素标记的核酸探针。这种标记方法称为缺口平移法。用标记在DNA上的生物素与链霉亲合素-酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）标记物进行检测。缺口平移法标记生物素DNA探针：在硅化Eppendorf管（放入冰浴中）加下列反应液：待标记DNA 0.1g/l 5l10NTB1lDNase I 2pg/l 1l消毒三蒸水 3l 总体积达10l混匀，37，15min。离心10000r/min 1min后，放入冰浴中，继续加入下列反应液：dNTP(ACG)0.5g/ml2lBio 11 dUTP 0.5g/ml2l10NTb4l 消毒三蒸水31l混匀，短暂离心后，加入DNA聚合酶I（5u/l）1l总体积50l混匀，14过夜（10h以上），加入终止液 2l经Sephadex G 50柱分离，回收生物素标记DNA。10NTB配法：500mmol/l Tris HCl, Ph7.5；100mol/L MgCl2；80mmol/L -巯基乙醇，500g/ml BSA。终止液：0.25mol/L EDTA, 10mg/ml tRNA和10mmol/l Tris HCl (pH7.5)。缺口平移法标记探针少量多次标记效果较好，即每次标记DNA不超过1.Bio 11-dUTP要浓贮，分装，-20。C保存，反复冻融常会降解失活。Bio 11- dUTP贮存液：10mmol/L即100g Bio-11-dUTP中加入11.6l Bio-11 dUTP稀释液，分装成3l/支，-20保存。地高辛-dUTP标记DNA也可按此法进行。乙醇沉淀分离回收标记DNA比较方便，即加入5l4mmol/l LiCl,125l冷乙醇，混匀，-20放置30min,12000r/min离心5min，去上清，用70%乙醇和无水乙醇洗沉淀物，倒置离心管，晾干，用消毒三蒸水5l溶解沉淀物（0.1g/l）-20。C保存。用LiCl 可较好地分离DNA和可溶性核苷酸，因为dNTPS的锂盐在乙醇中比钠盐溶解性更大。二、光敏生物素标记核酸探针光敏生物素有一个连接臂，一端连接生物素，另一端有芳基叠氮化合物。在可见光照射下，芳基叠氮化合物可能变成活化芳基硝基苯，很易与DNA或RNA的腺嘌呤N7位置特异结合，大约每50个碱基结合一个生物素，所以只用于标记大于200个核苷酸的片段。光敏生物素的醋酸盐很易溶于水，与核酸形成的共价结合很稳定。此法有以下优点：方法简便易行，快速省时，不需昂贵的酶和dUTP等；只需光照，探针稳定，-20可保存12个月以上。适用于DNA和RNA，抗体和酶等的标记。在原位分子杂交，斑点杂交和Southern印迹杂交中应用，其特异性和灵敏性较高，价廉易购，国内已有试剂盒供应，军事医学科学院放射医学研究所马立人教授等研制和生产的光敏生物素核酸探针和检测试剂盒使用良好。方法步骤：在一灭菌Eppendorf管中加待标记DNa 5g/10l，在暗室中加入5g/5l光敏生物素，充分混匀，插入冰浴中，置特制光源下10cm处照射20min。加入100mmol/l Tris HCl pH9.0, 1.0mmol/L EDTA 10l混匀。再加入等体积仲丁醇，混匀。离心1min（10000r/min）吸去上层仲丁醇，弃去。再加入仲丁醇25l，重复提取游离的光敏生物素。吸去上层无色仲丁醇后，加入5l 3mol/L醋酸钠，充分混匀，加入冷无水酒精100l充分混匀，沉淀标记DNA，置-20过夜（或-7015min）15000r/min离心20min，沉淀物再用70%乙醇洗一次，离心，抽干，溶于0.1mmol/l EDTA或TE中，测定探针浓度，分装，保存于-20。三、生物素-补骨脂素（Biotin -psoralen）标记法生物素-补骨脂素是另一种生物素光敏物质，在长波长紫外线照射下与嘧啶碱基发生光化学反应，加成到DNA中，去除小分子后，得到生物素标记核酸探针。此法可标记单链或双链DNA或RNA，及寡核苷酸。灵敏度与放射性探针相当。标记方法：取DNA或片段0.5g加50lTE（pH8.0）缓冲液中，再加入5lg生物素-补骨脂素，溶解后，置365nm紫外光下直接照射20min，距离5cm，加等体积TE，移入用TE平衡的Sephadex G50 柱（高1.0cm），离心法过柱，收集液体即为Bio DNA探针。四、生物素-氨基乙酸-N-羟基琥珀标记化学修饰的DNA法此法是在亚硫酸盐催化下，生物素酰肼可置换寡核苷酸探针中胞嘧啶上的氨基，使生物素结合到DNA分子上而制成生物素化DNA探针。此法优点是采用通用试剂和技术，检出敏感。Vicied 等人指出DNA和RNA中胞嘧啶N-4位置在亚硫酸氢盐存在下可用乙二胺连接臂修饰，此过程也可能介导C-6位的磺酸盐组分。在合适的条件下，可有3%4%的碱基被修饰。新鲜配制亚硫酸氢钠-乙二胺混合液，两者混合液含量分别为1mol/L和3mol/l （pH6.0），加入对苯二酚，使终浓度为1mg/ml。将DNA用超声打成500800bp长度的片段，煮沸法变性，取1份DNA与9份上述混合液混合，42水浴3.5h。用5mmol/L磷酸钠缓冲液（pH8.5）在40下充分透析，浓缩DNA，再溶于200l 0.1mol/L磷酸钠缓冲液（pH8.5），再加入4mmol/L生物素-氨基乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺脂，室温反应2h，用含150mmol/l NaCl、1mmol/l EDTA的10mmol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）在40下充分透析，纯化，-20保存。五、缺口平移法标记生物素DNA探针（二步法）取HBV质粒DNA0.5g,DNase I(SABC)2pg, 10NBTl，三蒸水补足体积至10l，37，15min；加5mmol/l dATP dGTP dCTP Bio 11- dUTP各2l，10NBt 4l，三蒸水补足体积至10l,37，15min；三蒸水补足体积至49l，DNA聚合酶i 5u，混匀，14过夜，加0.5mmol/l ED-TA(Ph8.0)1l终止反应。已标记探针的提纯：10mg/ml tRNA 2l,10mmol/L Tris HCl (pH7.5) 150l,2.5倍体积的95%乙醇，置液氮中15min或-20过夜。15000r/min，离心10min，真空干燥后，溶于适量三蒸水中，即为纯化的探针，-20备用。使用闭环或线性双链质粒DNA，或分离的双链DNA片段均可进行此法标记，全质粒标记敏感性较高，因为标记物可同时掺入载体DNA。此法也可用于放射性同位素和地辛标记DNA法。六、生物素随机引物标记探针方法以HBV DNA为例。取HBv DNA质粒0.5g，随机引物（Pharmacia）2g，用TE（pH8.0）补足体积至10l；100，热变性5min，骤冷10min。加10缓冲液（500mmol/l Tris HCl (Ph6.6),100mmol/L MgCl2, 10mmol/L 巯基乙醇），BSa 500g/ml 5l，5mmol/l dATP/dGTP dCTP各1l，按不同比例加入Bio 11-Dutp,和dTTP，用三蒸水补足体积至48l，加DNA聚合酶（SABC）8u，混匀，37，2h，加0.5mol/l EDTA(Ph8.0)2l，终止反应。在随机引物标记体系中，加入不同梯度浓度比值的Bio-11-dUTP/dTTP(%)，发现二者比值明显影响探针标记率和显色灵敏度。Bio-11-Dutp/dTTP（%）比值为35%时，其标记率最高，显色灵敏度达0.2pg，杂交灵敏度为12pg。二步法缺口平移标记HBv DNA探针，其灵敏度低于随机引物标记。Mackeg等（Focus,1992；14：21）证实了用随机引物标记探针具有放大的效应。随机引物中加入一定比例的dTTP，能增加HBv DNA探针的标记率和灵敏度。其灵敏度接近同位素标记探针的灵敏度。七、异羟基洋地黄毒甙（Digoxigenin）标记核酸探针1988年德国Boehringer Manheims公司推出了一种地高辛标记DNA检测试剂盒。先将地高辛甙元通过一手臂联接至dUTP上，用随机引物法标记DNA制成探针。平均每2025个核苷酸中标记一个地高辛甙元，然后用抗地高辛抗体的Fab片段与碱性磷酸酶的复合物和NBt BCIP底物显色检测，灵敏度达0.1pg DNA，因此可做1g哺乳动物DNA中单拷贝基因分析。此种探针有高度的灵敏性和特异性，安全稳定，操作简便，可避免内源性干扰，是一种很有推广价值的非放射性标记探针。标记方法步骤：（1）取一小离心管（0.5ml）插入冰浴中，加入待标记DNa 1g/5l，95变性10min，迅速移入盐冰中3min。加入六核苷酸引物2l，Dig-dNTP标记物2l和消毒双蒸水10l、大肠杆菌DNA聚合酶i Klenow片段1l(单位)。（2）短时离心，37孵育至少60min（20h以内）。（3）加入2l 0.2mol/L EDTA溶液中止反应。再加入2.5l 4mol/L LiCl和75l预冷的乙醇（-20），放入-70至少30min或-20过夜。（4）离心（12000g）10min，弃上清，再加入70%乙醇（冷）40l洗一次，离心，抽干，再溶于50l TE溶液（pH8.0）中，分装，-20存放备用。八、光敏2，4-二硝基苯（光敏DNP）标记DNA法光敏DNP由一连接臂组成，一端是2，4-二硝基苯，另一端有芳基叠氮化合物。此法适用于含氨基检测基团。其敏感性和光敏生物素标记探针相同，检测时需要抗DNP抗体和免疫化学显色。标记方法：（1）DNA不心变性，必须溶于水中，取210g10l，加入二甲亚砜25l，每微克DNA加入光敏DNp 2g（在避光条件下），混匀。（2）置入冰浴中，在特制灯10cm下照射10min。（3）加入水165l，4mol/L醋酸钠20l和异丙醇50l，混匀。（4）用705和无水乙醇沉淀各一次，晾干，按50g/ml溶于200l水中，如探针不溶时，可在60水溶中加热10min，离心5min，除去不溶性杂质，分装，-20可保存12年。此法简便，不仅适用于核酸标记，也适用于蛋白质标记。九、三硝基苯磺酸（TNBS）标记核酸探针在温和的条件下，TNBS将核酸的胞嘧啶转化为N-甲氧基-5，6-二氢嘧啶-6-磺酸盐衍生物，对胞嘧啶残基进行磺化修饰制成磺化半抗原探针。此法十分简便，也可用于蛋白质的标记。标记方法：取变性单链的DNA5g，溶于0.02mol/L硼酸钠缓冲液（pH8.6）中，加入TNBS5g溶解，在室温中反应1h。移入冰浴中，加入无水乙醇和70%乙醇各洗1次，晾干，用50l消毒双蒸水溶解，分装，-20保存备用。十、生物素化的RNA探针标记RNA探针比cDNA探针的敏感性提高10倍以上，在许多优点。它们是单链，不需变性，也没有互补链的干扰，与靶基因杂交比DNA探针更稳定。Bio-11-dUTP可通过Sp6、T3和T7RNA聚合酶掺入到RNA转录子中。标记方法：其下列反应体积为50l：40mmol/l Tris HCl pH8.0、8mmol/l MgCl2、2mmol/L亚精胺、25mmol/l NaCl, 1mmol/L每一ATP、GTP、GTP，1mmol/L生物素Bio-11-Dutp,500ng模板，45u T3RNA聚合酶。混合，37反应1h。加入10%SDS终止反应。凝胶过滤分离标记RNA探针。十一、辣根过氧化物酶标记核酸探针法此法标记原理如下图所示：标记的HRP部分催化底物化学发光反应：氨基苯二甲酰肼氨基苯二甲酸+N2+光X-光片上感光1020min显定影。光亮子在酚、萘及胺类等增强剂促进下，而使光亮增强。这种方法就是利用特殊的酶底物，氧化后把产生的能量转变为光能放出，称为化学发光。杂交后与探针结合的酶催化相应的发光剂，经增强剂将光能放大，在X光片上显示杂交信号。此方法灵敏度与同位素标记水平相当，简便快速，安全，是一种特异性好的检测手段，具有广泛的应用前景。HBV-DNA的HRP标记方法：质粒中插入HBV全基因组DNA，长3.2kb，载体为PBR322质粒，4.3kb。将质粒DNA用三蒸水稀释成10ng/l，取20l放入EP管，100变性5min，加入20u HRP标记试剂，混匀，加入戊二醛20l混匀，3710min，此时可立即使用，或放在冰浴中1015min内使用，或加入50%去离子甘油-20保存供分子杂交用，可存放6个月。十二、用聚合酶链反应标记高活性DNA探针聚合酶链反应（PCR）或称体外基因倍增技术，它利用一对位于待扩增的DNA序列两端的取向相对的DNA引物，在DNA聚合酶的介导下，经过多次变性，退火和延伸过程的重复性循环，大量合成靶DNA序列。在标记dNTP存在时，经PCR反应产生的靶DNA片段均参入了标记物，用此法标记的探针标记率高达97.4%。此法重复性好，简便、快速、特异、不要求模板DNA的纯度，可以大量制备。此法有普遍应用价值。标记方法如下：待标DNA模板1ng,50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH8.4),2.5mmol/L MgCl2 dATP、dCTP、dGTP各200mol/l dTTP150mol/Ll,Bio-11-dUTP 50mol./L, 引物各1mol/L，明胶200g/ml，2u Taq DAN聚合酶，总反应体积为100l。混匀后，加石蜡油封顶，94和55各2min，723min，经25个循环后，可产生510g标记探针，需时仅4h。乙醇沉淀扩增的产物后，溶于100l TE中，分装-20。采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA探针中。RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。 对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。1 地高辛标记核酸探针的主要标记方法1. 1 DNA 探针的标记方法1. 1. 1 PCR 掺入法 这种标记方法是通过聚合酶链式反应，在Taq 酶的作用下，将DIG-11-dUTP 掺入到新合成的DNA 链中。以本法标记的探针不但灵敏度高，产量也很高。少量的基因组DNA(1ng50ng) 便可直接通过PCR 进行扩增、标记。1. 1. 2 随机引物法 用随机引物法可将DIG-11-dUTP 标记于DNA 链上。为得到最佳标记效果，标记前模板DNA 需作线性处理，而且至少要用苯酚-氯仿进行一次抽提，再用乙醇沉淀。10010000 碱基的模板链均可被有效地标记，但大于10000 碱基的模板链则需要在标记前作限制酶切消化。处理好的模板加入随机引物，按碱基互补原则，随机引物与模板DNA 退火后由Klenow 片段从引物3 端延伸引物，便可将DIG-11-dUTP 均匀掺入到新合成的DNA 链中。1. 1. 3 切口平移法 切口平移法DNA 探针技术快速简便，且已非常成熟。先用适量的DNase I 在双链DNA 上打开若干个单链缺口，然后在E. coli DNA 聚合酶I 的5- 3 外切活性和聚合活性的共同作用下，在缺口的5 端切除单链DNA 序列，随之由新合成的带有地高辛标记的脱氧核苷酸链取代。本法适用于环形DNA 或大于1kb DNA 片段的标记。用于原位杂交的核酸探针，通过切口平移法标记最为有效。因为此方法可通过控制DNase I 的酶活性得到适当的缺口，从而得到长度大小适宜的探针，而探针的大小是原位杂交的一个重要参数，足够小的探针才可能穿透组织或细胞。1. 2 寡核苷酸探针的标记方法 合成的寡核苷酸探针被广泛应用于筛选基因文库、Southern 印迹、Northern印迹、斑点印迹及原位杂交试验。地高辛标记寡核苷酸有三种方法:3 末端标记、5 末端标记以及在探针3 端加上数个DIG-11-dUTP 分子的尾巴(图2) 1. 2. 1 3 末端标记法 3 末端标记法的主要特点是在每个合成的寡核苷酸(长度为14100bp) 的3 末端只添加一个地高辛残基(DIG-ddU TP)。用此方法标记寡核苷酸时,除末端转移酶外,无需其它特别的寡核苷酸合成试剂,方便快捷。所合成的探针适合于要求探针具有较高的特异性而灵敏度一般的试验,如Southern 印迹、Northern 印迹、斑点印迹及菌落P噬菌斑杂交实验。1. 2. 2 5 末端标记法 5 末端标记法是通过化学方法将地高辛标记于寡核苷酸的5 末端。首先在5 末端连接上一个氨基连接臂残基,将合成的寡核苷酸纯化后,再使DIG-NHS 与5 末端的氨基残基发生共价结合,从而形成标记探针。这类探针的一个主要优点是其3 端在DNA 合成反应中充当引物,使反应产物得以标记。1. 2. 3 3 末端加尾法 3 末端加尾法是由末端转移酶在探针3 末端加上数个地高辛残基的尾巴。此方法标记的探针灵敏度较3 末端标记法要高出10 倍左右,但由于存在长尾巴,往往会出现较严重的非特异性背景。1. 3 RNA 探针的标记方法 通过RNA 聚合酶SP6 、T7 或T3 经体外转录可将地高辛标记于RNA 探针上。用地高辛标记的RNA 探针具有很强的信号能力,且非特异性背景少,在Southern 印迹和Northern 印迹实验中,效果明显优于同为地高辛标记的DNA 探针,可与放射性同位素标记探针相媲美。另外,在筛选菌落P噬菌斑及原位杂交的实验中,RNA 探针也同样具有良好的效果。而且,由于DIG与UTP之间的键合对碱性不敏感,可通过碱处理方法得到所需大小的探针。2 影响探针标记方法选择的因素使用地高辛系统时,可根据地高辛系统的不同用途、所获得的用以制备探针的模板类型、以及探针可达到的灵敏度,选择探针标记方法。总体而言,DNA 模板的纯度越高,标记的效率也越高。在进行标记前,应使用苯酚、氯仿抽提DNA 模板。此外,对于随机引物标记DNA 的方法而言,在标记反应之前,先将模板线性化并加热变性是至关重要的;而对寡核苷酸