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项目类别重点优秀青年 所属学科： 中医学一般湖南省教育厅科学研究项目申 请 书项 目名 称：基于TLR-NK-kB信号通路探讨大承气汤对肠源性脓毒症模型鼠干预作用的分子机制申 请 者：孙必强所 在 学 校：湖南中医药高等专科学校电 话 真：电子信箱 (Email):Q申 请 日 期：2013年3月29湖南省教育厅2013年制11填 报 说 明一、申请书各项内容，要实事求是，逐条认真填写。表达要明确、严谨。外来语要同时用原文和中文表达。第一次出现的缩写词，须注出全称。除签名外，项目申请书必须是打印件。二、申请书一律用A4纸，于左侧装订成册。第二页起各栏空格不够时，请自行加页。如有查新报告及其它附件材料，请连同申请书一起装订成册。附件不超过20页。 三、“所属学科”按湖南高校科技网政策法规栏公布的二级学科名称填写，“项目类别”在“重点”、“优秀青年”、“一般”三类中选择。（封2，此页不装订）一、简表项目名称基于TLR-NK-kB信号通路探讨大承气汤对肠源性脓毒症模型鼠干预作用的分子机制研究类型基础研究（） 应用研究（ ） 试验发展（ ）研究年限2014年 至 2016 年 3年申请经费（万元） 4.0万项目负责人姓名孙必强学位硕士职称讲师身份证号要学习和工作经历(自大学开始)19982001 大同医学专科学校 中西医结合专业学习20012003 山西中医学院 中西医结合专业学习20042007 湖南中医药大学 中药学专业学习2007至今 湖南中医药高等专科学校 教学2013至今 湖南中医药大学 中西医结合临床专业在职博士学习联合申请单位其它主要研究人员姓 名职 称已获学位专业本人签名所在单位身份号码二、立论依据 （包括项目的研究意义、国内外研究现状分析） 1 脓毒症（sepsis）是指各种致病微生物或其毒素存在于血液或组织中，导致机体对感染产生剧烈的全身性炎症反应综合征(systematic inflammatory response syndrome，SIRS)。本症是感染、休克、创伤、烧伤等临床危重患者常见严重并发症之一，其一旦演变为脓毒性休克（septic shock，SS）、多器官功能障碍综合征(multiple organ olysfunction syndrome，MODS)或急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），则治疗困难、预后极差，易致患者死亡【1-5】。尽管人类已经进入分子医学时代，但脓毒症发病率及死亡率居高不下。以美国为例，1979年发病率为8217/10万，2000年已升至24014/10万,病死率28.6%【6】在2003年，对德国310家ICU的研究表明，脓毒症和严重脓毒症的发病率分别为12%和13%【7】。国内在20022005年的一项对11省市37家医院1087例重症患者的前瞻性、多中心研究显示，脓毒症发病率为77.6%，脓毒性休克发生率为38.9%，两者的病死率分别为63.3%和71.4%【8】。在脓毒症的治疗中，【除常见的创(烧)伤创面、吸入性损伤及医源性污染等外源性感染外，约13的患者体内始终找不到原发感染灶，虽经各种抗生素治疗终究未能控制脓毒症而发生MODS，进一步观察到这类患者及动物模型体内常表现明显的肠道细菌移位现象，诱发和或造成严重创伤、休克、感染后“二次打击的发生、发展【9】。因此研究人员推测胃肠道是这类脓毒症患者的细菌感染源。20世纪60年代，Ravin等提出胃肠道是发生多器官功能衰竭前无明确感染灶的病人发生脓毒症的潜在致病源。1986年Meakins等提出“胃肠道是MODS的始动器官”的著名论点【10】。1987年Border等进一步提出肠源性脓毒症(gut origin sepsis，GOS)的概念。目前已有研究表明：胃肠道可能是促发SIRS失控的重要病理环节，其在SIRS、脓毒症、MODS的连续发生发展中起重要作用。肠道是人体最大的细菌及内毒素贮存库。生理情况下，依赖于宿主完整的胃肠黏膜屏障、胃肠道菌群的微生态平衡及健全的免疫防御系统，肠腔内细菌及其主要产物(内毒素)并不危害机体健康。但病理情况下,在多种应激因素作用下，机体胃肠黏膜屏障功能受损、胃肠道菌群微生态学异常、宿主免疫功能抑制或全身防御系统受到严重破坏，细菌及内毒素通过受损肠黏膜屏障迁移到肠系膜淋巴组织、淋巴液、血液和肠外组织器官，从而诱发肠道细菌移位或内毒素血症，进一步发展可引起肠源性脓毒症(gut origin sepsis,GOS),甚至诱发脓毒症休克（septic shock，SS）和多器官功能衰竭MODS(multiple organ olysfunction syndrome，MODS)。虽然当前医疗条件不断改善,但肠源性脓毒症的病死率一直居高不下，并成为外科危重症患者的主要死亡原因之一，故胃肠道因素在脓毒症发生、发展中的作用不容忽视。2 肠源性脓毒症与TLR-NF-kB通路 脓毒症的发生，Wenzel等【11】认为是机体在SIRS基础上合并感染的过程,Beal等【12】也认为是感染等因素逐步引起的SIRS。不管怎样,它总是包括SIRS及感染两个基本过程,两者相互影响,促进脓毒症的发生。GOS作为一种特殊的脓毒症,其发生过程也是如此,仅其感染方式较为特殊，即肠道细菌移位，故其与机体参与炎症通路有密切关系。核转录因子（NF-kB）是一种广泛存在于真核细胞内的基因多向性转录因子，属Rel家族，于1986年首次在小鼠B淋巴细胞的核抽提物中发现，因能与免疫球蛋白k链基因的增强子kB序列（GGGACTTTCC）特异性结合而命名。NF- kB信号转导通路是肠源性脓毒症重要的下游通路。与有活性的DNA结合的经典NF- kB信号是一个二聚体（p50和p65的二聚体），静息状态下，NF-kB以无活性的潜在状态存在于细胞浆中，它与一种抑制因子IkB结合组成一个三聚体p50-p65-IkB。当细胞受到TNF-、IL-1等炎性因子刺激时，IkB即从三聚体中解离出来，暴露出p50亚基上的易位信号和p65亚基上的DNA结合位点，从而使此异二聚物表现出NF-kB活性，并从胞浆中进入到细胞核中，与kB基序（kB motif)相结合，从而发挥转录调控作用。因此 NF-B 在调节免疫应答、炎症反应、细胞增殖、分化及凋亡等方面起关键作用【13】。Toll样受体 ( Toll-like receptors，TLRs )家族是I型跨膜蛋白受体，具有信号传导功能，是先天免疫系统中跨膜受体和模式识别受体之一，其诱导和调控的细胞因子和炎性递质在GOS中占有重要的地位。在炎症反应过程中，TLR2和TLR4的研究比较透彻。TLR2具有广泛的识别能力，TLR4对LPS的信号非常重要。TLRs一旦与体内特异性配体结合后，通过MyD88依赖的信号通路或通过MyD88非依赖的信号通路激活Ik B激酶（IKK），从而激活NF-B，诱导一系列炎症细胞因子的表达，如TNF-、IL-、IL-2、 IL-6 、IL-8等。当机体处在脓毒症的进程中，会释放大量的TNF-，TNF-与TLRs结合【14】后，TLR激活肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）【15】，,TRAF6被磷酸纤维素化后，可降解NF-kB抑制蛋白（Ik B）【16】，Ik B的降解使NF-kB的静息状态得以解除，NF-kB转入细胞核中诱导特定基因的表达。NF-kB活化后可以增强TNF-、IL-1等细胞因子的转录基因【17 18】使其产生和释放增多，其正反馈反应使得NF-kB继续增多，出现炎症介质的“瀑布样级联”反应的作用，又使炎症介质IL-6产生和释放增加。脓毒症发病机制非常复杂，与内外毒素的侵入，炎症反应的强弱，免疫应答机组织损害等有密切关系，而TLR-NF-kB通路是炎症反应时机体产生免疫应答和炎症反应的关键信号系统。3大承气汤治疗肠源性脓毒症祖国传统医学中并无肠源性脓毒症之说，据其临床特点，本病应归属于中医学伤寒、温病之范畴。其基本病机是热毒阻弊，气滞血瘀，治宜清热解毒、通腑利气、活血化瘀。大承气汤出自伤寒论，方中大黄泻热通便，荡涤肠胃，兼有活血化瘀之效，为君药；芒硝助大黄泻热通便，并能软坚润燥，为臣药，二药相须为用，峻下热结之力甚强；积滞内阻，则腑气不通，故以厚朴、枳实行气散结，消痞除满，并助硝、黄推荡积滞以加速热结之排泄，共为佐使。全方用药虽少，但其峻下热结功效显著，主治阳明腑实证、热结旁流以及里热实证之热厥、痉病或发狂等。现代研究表明，直肠黏膜有很强的吸收能力，药物通过肠道内静脉进入大循环而发挥治疗作用。有研究【19-23】也证明这里文献重新查。，大承气汤有抑制血清内毒素、降低炎性细胞因子、双向调节免疫、抗菌、改善肺水肿、促进肺泡上皮增生、保护多脏器功能等作用。另相关研究表明【24-26】，以大承气汤为主的通里攻下法能够增加胃肠蠕动,改善胃肠功能,促进新陈代谢,清除肠道内细菌和毒素;活血化淤,改善微循环,解除胃肠缺血缺氧状态,降低肠黏膜毛细血管通透性和内毒素易位;还可以降低炎性介质的产生和释放大承气颗粒不仅可抑制SS病人以TNF-为代表的促炎因子过度分泌,还可促进抗炎介质IL-10、PGE2的下降,促进Th细胞漂移和HLA-DR表达下降的恢复,有利于免疫平衡的恢复【27】。4.提出假说：TNF-作为脓毒症时炎症级联反应启动过程中的早期炎症介质，是炎症发生时的上游信号，上述相关研究表明大承气汤能降低其表达水平。而TLR-NF-kB通路是一条经典炎症反应信号通路，基于临床中大承气汤对肠源性脓毒症治疗有效，推测其应对TLRs或（和）NF-kB的表达也应有一定的抑制作用，从而影响TLR-NF-kB信号通路。参考文献：1.姚咏明 ，柴家科 ，盛志勇烧伤脓毒症的诊断标准与防治中华烧伤杂志 ，2003，19(2)：65-662.Liboni KC，Li N，Scumpia PO，et a1Glutamine modulates LPS-induced IL-8 production through IKBNF-KB in human fetal and adult intestinal epitheliumJJ Nutr，2005，135(2)：245-2513.强新华，康焰.脓毒血症和感染性休克的治疗现状J华西医学杂志，2005,20（4）：791-7924.Dellinger RP，Levy MM，Carlet JM，et alSurviving Sepsis Campaign:intenational guidelines for management of severe sepsis and septic shock:2008JCrit Care Med ,2008,36(1):296-3275.ZambonM，Ceola M，Almedia-de-Castro R，et alImplementation of the Surviving Sepsis Campaign;intenational guidelines for severe sepsis and septic shock:We could go fasterJJournal of Critical Care，2008,23:455-4606. 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TLR2、TLR4、NF-Kb/P65mRNA四、可行性分析(1)项目申请者有多年从事中医临床工作和复方药理学研究工作经验，主持完成1项省级课题，参加过4项省市级科研项目。(2)目前申请者在湖南中医药大学攻读中西医结合临床专业学习，相关的学习背景也能为课题的保质保量完成提供