定量PCR实验数据处理.docx

定量PCR实验数据处理1.定量PCR的实验要素目标基因未知样品生成标准曲线标准品梯度监控系统故障阳性对照监控污染阴性对照校准生物学误差管家基因(IPC)校准物理误差参比荧光(ROX)降低其余误差重复实验96孔板设置举例样品标准品目的：生成标准曲线，建立CT值与浓度之间的数学关系不要求：数学关系是抽象的，不要求标准品与目标基因使用相同的DNA可以使用相同的DNA也可以使用不同的：PCR产物、质粒、病毒、人工合成片段要求：5点以上浓度已知PCR效率一致，且接近100%仪器一致反应条件一致：循环参数、同一次实验试剂质量一致：模板、引物和探针Tm值、酶及缓冲液梯度稀释方法选择目标、提取/PCR、纯化、测定浓度、调整浓度、梯度稀释CT值在18-30之间，覆盖全部样品浓度区间10倍连续梯度稀释方法：1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv1v 标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v切不可由标准品I分别加不同体积的稀释缓冲液直接得到标准品ii、iii、iv、v 标准品单位标准品的性质决定最终结果的性质：DNA 标准品，已知拷贝数绝对定量，得未知样品拷贝数DNA标准品，已知ng/uL绝对定量，得未知样品ng/uLDNA标准品，未知拷贝数或浓度，已知稀释倍数相对定量，得未知样品之间相差倍数RNA标准品，已知ng/uL，与未知样品同样反转录，梯度稀释cDNA相对定量，得未知样品ngRNA/uL注意测定对单位的要求如果要求测定样品的基因拷贝数，梯度稀释已知摩尔浓度的DNA片段如果要求测定样品的重量百分比%(w/w)，如转基因，标准品是将转基因与非转基因食品粉末按重量比混合，然后抽提混合DNA；切不可先抽好转基因DNA，再梯度稀释，也不可分别抽提转基因与非转基因DNA，再按重量比例混合（这样得出的是基因重量百分比，而不是样品重量百分比）PCR效率对定量结果的影响测定PCR效率标准品DNA与目标DNA必须是一样的吗？当检测多个基因时，需要分别做标准曲线吗？做几条标准曲线？Relative Standard CurveComparison of the c-mycexpression level in brain, kidney, liver and lungStandard: Raji Cell line total RNAEndogenous Control: GAPDH管家基因IPC通常以uL或者ug为单位取样细胞培养液：同样体积，细胞数目并不同样DNA溶液：抽提效率和操作误差，同样体积的DNA并不来源于同样数目的细胞copy/uL 要校正成copy/cell才有意义IPC 的定义什么是什么是IPCIPCIPC通常选用管家基因它与目标基因在相同的PCR条件下具有相似的扩增效率IPCIPC 的作用的作用监控PCR抑制物、DNA/RNA提取的损失、操作误差等对定量数据的影响，并对以上原因造成的定量误差进行修正。IPC 的选择标准-在所有待测样品中，内对照(Endogenous Control)的表达量都恒定不变-注意所选基因是否是组织依赖的、发育阶段依赖的、或者处理方式依赖的-多重定量时，内对照的表达量最好比目标基因高-推荐使用Human Endogenous Control Plate (P/N 4309920)测试不同管家基因的效果-常用的内对照有18S rRNA、-actin、GAPDH等在使用TaqMan MGB探针的情况下，你认为管家基因与目标基因是在同一管内做多重定量好，还是分成两管分别定量好？哪一种检测的数据更精确？扩增效率要一致曲线斜率6未知样品和标准品都要重复所有复管在同样条件下完成PCR你为什么会想到做多重定量？多重定量能达到目的吗？定量PCR的数据处理绝对定量与相对定量绝对定量与相对定量绝对定量优点：给出目标基因的绝对数量，数据容易处理 缺点：必须有标准品，做标准曲线，难以制备和质控相对定量优点：可以不做标准品；标准品容易制备；使用广泛缺点：数据理解困难绝对定量：绝对标准曲线法目标：测定目标基因的准确拷贝数绝对定量误差的校正生物学方面的误差：IPC校正细胞数量的差异、抽提效率、纯化损失、反转录效率等物理方面的误差：ROX校正枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动）的误差等其余的误差：统计校正重复实验，取平均值绝对定量的数据处理 管家基因校准(Normalization Gene)相对定量有两种方法定义：比较同一基因在不同样品中的表达量结果：数据是%，没有单位方法：相对标准曲线法和CT法应用：应用最广泛，功能最强大相对定量：相对标准曲线法标准品：可以只知道梯度稀释的稀释倍数相对定量误差的校正生物学方面的误差：IPC校正细胞数量的差异、抽提效率、纯化损失、反转录效率等物理方面的误差：ROX校正枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动）的误差等其余的误差：统计校正重复实验，取平均值相对定量的数据处理管家基因校准 (Normalization Gene)得出每个细胞中的目的基因目标基因vs. 管家基因对照样品校准 (Calibrator Sample)得出相对于某个样品的基因表达量, 1X sample.处理的vs. 未处理的，6hr vs. 0 hr, 病理vs. 正常.相对标准曲线法计算示例相对定量：CT法依据：平均相对含量% = 2 平均CT好处：不做标准曲线CT=CTUnknown-CTCalibrator=% 与CT的关系平均相对含量= 2 平均CT%与CT的关系平均相对含量 = 2 平均CTCT法计算示例注意：如果反应效率不高，则差别被高估。当CT= -1.2 E=1，2.3 倍差别E=0.9，2.2倍差别E=0.5，1.6倍差别CT法相对定量要