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western bolt实验操作步骤WESTERN BLOT操作步骤聚丙烯酰胺凝胶电泳u 灌胶：注意：Acrylamide（聚丙烯酰胺）剧毒，需戴手套操作。1、将玻璃板用清洗剂洗干净后，自来水冲洗干净，蒸馏水冲洗三遍（勿用酸泡）。2、固定好玻璃板，配置分离胶溶液(10ml两板，一板可以减半配制)根据分子量选择相应浓度的分离胶。胶浓度超纯水凝胶储备液Gel bufferPH8.810%SDS10%APSTEMED10%常用4.1ml3.3ml2.5ml0.1ml50l15l12%小分子量3.4 ml4.0 ml2.5ml0.1ml50l15l8%大分子量4.7ml2.7ml2.5ml0.1ml50l15l3、用1000l移液器吸取分离胶溶液，缓缓灌入夹缝中，勿产生气泡，每板大约4.5ml，灌完后再胶顶部加无水乙醇封闭。4、待分离胶凝固（约40min）倒掉无水乙醇，用超纯水清洗三次，用滤纸洗掉多余水分。5、配制浓缩胶溶液（10ml-四板量，两板可减半配置）。胶浓度超纯水凝胶储备液Gel bufferPH8.810%SDS10%APSTEMED5%5.7ml1.7ml2.5ml0.1ml50l20l6、灌浓缩胶，并插梳子。7、室温聚合30-45min，将玻璃板固定于电泳槽内，倒入适量的1电泳缓冲液，拔出梳子。u 上样，电泳上样：20l移液器逐个加样，（第一道加5RSB小于4l和Matker 4l,空泳道加5RSB 5l）。加适量1电泳缓冲液，接好正负电极。开始设置为90V恒压，观察marker的移动情况，尽量拉长自己感兴趣的区域，适时终止电泳。转膜。电泳： 1、将建勇后的胶取出浸入转膜液，（注意胶方向，做好标记）摇床缓慢摇30min。戴手套裁取PVDF膜(8.35.2cm)，甲醇浸透，倒掉甲醇，浸入转膜液中，至少5min。将取下胶的玻璃板清洗干净2、用转膜液润湿一张厚滤纸，铺于半干转印仪的底层电极版上，将PVDF膜铺于滤纸上，勿留气泡，将凝胶贴于PVDF膜上，不留气泡。3、润湿另一张厚滤纸，盖在凝胶上面，用玻璃试管赶去气泡。4、盖上顶层电极板、接通正负极电源，15V(不超过25V )转印20min。5、配封闭液。u 杂交1、 取出PVDF膜，和胶相邻面向上浸入封闭液置于摇床缓慢摇1hr以上。2、 倒掉封闭液，用洗膜液略洗一下，取15ml离心管，加入5ml杂交液。按适当比例稀释一抗(按说明书要求)，管上注明抗体名称、来源、分子量和稀释比例。摇床上室温杂交2hr或4C杂交过夜。3、 取出PVDF膜，用TBST洗3次，每次5min。4、 倒掉TBST，把PVDF膜放入装有二抗的15ml离心管中，摇床上杂交1hr。5、 取出PVDF膜，用TBST洗3次，每次5min。u ECL反应1、 倒掉洗膜液，吸去多余液体，转膜时与胶相邻的一面向上，铺于玻璃板上。2、 将ECL试剂盒内的detection reagent 1与detection reagent 2等体积混合后，均匀滴在PVDF膜上，反应1-2min。3、 上机检测。u 注意事项 大部分试剂有累积毒性，必须佩戴手套操作。 玻璃板贵且易碎，使用时轻拿轻放，用完刷干净放于板架上。 移液器使用完调至最大量程放在枪架上。 梳子使用完拿水冲净。 制胶架上的胶条，制胶完毕后需用水冲净擦干，用完放回原位。 半干转印仪使用完需拿纸擦干电极板。 实验完毕，实验台收拾干净，废液缸倒净，关闭仪器电源。试验方法（样品篇）1. 样品制备BCA法测定蛋白质浓度BCA蛋白测定试剂盒（BCA Protein Assay Kit）是根据目前世界上最常用的两种蛋白浓度检测方法之一BCA法研制而成，实现了蛋白浓度测定的简单，高稳定性，高灵敏度和高兼容性。测定蛋白方法根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂（50：1）配置适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。2. 完全溶解蛋白标准品，取10微升稀释至100微升，使终浓度为0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但为了简便起见，也可用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。3. 将标准品按0，2，4，8，12，16，20微升加到96孔板的标准品中，加用于稀释标准品的溶液补足到20微升。4. 加适量体积样品到96孔板的孔中，加稀释标准品的溶液到20微升。5. 各孔加入200微升BCA工作液，37放置30分钟。注：也可以室温放置2小时，或60放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果温度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。6测定A562或540-595nm。根据标准曲线计算出蛋白浓度。7根据测定的蛋白浓度。按照上样要求制作样品。加入RBS和TBS。完成后沸水煮5分钟，零下20度可保存数月。WESTERN BLOT常用液体配方 中心实验室内部文件l 凝胶储备液（30%Acer/Bise）Acrylamide 58gBise-acrylamide 2g加超纯水溶解（约100ml）定容至200ml，4棕色瓶避光保存l Gel buffer pH：8.8 (分离胶用)Tris-base 36.3g加超纯水溶解（约100ml）用浓HCL调PH值至8.8加超纯水定容至200ml 4保存l Gel buffer pH：6.8 (浓缩胶用)Tris-base 12.1g加超纯水溶解（约100ml）用浓HCL调PH值至6.8加超纯水定容至200ml 4保存l 10%APS:过硫酸铵（APS） 0.1g加超纯水至1ml新鲜配制，4可保存10天l 10%SDS（十二烷基磺酸钠）SDS 10g加超纯水至100ml 室温保存l 10* TBSTris-base 61gNaCl 90g加超纯水溶解，调pH值至7.6定容至1000mll 10*电泳缓冲液（Running buffer）Tris-base 30.3gGlycine 144gSDS 10g加超纯水定容至1000mll 转膜液 (1000ml)Tris-base 3.03gGlycine 14.4g加超纯水至850ml，加甲醇150mll 杂交液（稀释抗体用）0.05g BSA加TBST至500ml 4保存l TBST转膜液1*TBS 1000ml（取900ml超纯水+100