离子色谱-脉冲安培法测定链霉素及杂质.doc

离子色谱-脉冲安培法测定链霉素及杂质摘要：本文采用离子色谱-脉冲安培法测定链霉素以及其杂质的含量。采用Carbonpac PA1阴离子分析柱分离，以电化学为检测器。用去离子水提取YPD发酵液的链霉素，以16000r/min的速度离心后，上清液稀释100倍直接进样分析。实验结果表明，在一定的色谱条件下，链霉素及其杂质离子具体很好的线性，和重现性，及较低的检出限。 关键词：离子色谱；脉冲安培；链霉素 新霉素是水溶性的氨基糖苷类抗生素复合体，一般是从放射菌类链霉素的发酵产物中纯化出来的，主要用于静脉注射以治疗感染。在临床使用前，链霉素在使用之前必须测定主成分以及标注所有的杂质成分。氨基糖苷类抗生素及其杂质的结构和糖类似，都没有明显的发色基团，用紫外可见光检测器的灵敏度达不到要求。另外在制备和贮藏过程中引入的一些中间体或杂质具有较好的紫外或可见光吸收基团，使用紫外可见光检测器直接进样分析会有很大的干扰链霉素A及其杂质的定量。示差折光率检测器与紫外可见光检测器的局限性类似。在本文中采用高效阴离子交换色谱（HPAE）分离链霉素A及其杂质 13，17，选用的CarboPac PA1阴离子交换柱对链霉素A及其杂质进行分离，采用EG50淋洗液发生器，采用一次性金（Au）工作电极作为电化学检测器的工作电极。此方法精确度好、检出限低、线性和方法的重现性好17，25，26。图1.检测链霉素和二氢链霉素的色谱图2. 70和63mM NaOH分析链霉素的对比1实验部分1.1 仪器及试剂Dionex ICS3000系统，包括D梯度双泵 或者SP梯度单泵（带有真空脱气装置和GM-4梯度混合装置），DC检测器模块(带双温控区)，20 uL进样环，ECD电化学池配复合pH/Ag/AgCl参比电极，一次性金工作电极；AS自动进样器（带分流阀）以及2ml进样瓶；Chremoleon工作站。氦气（99.995）；过滤装置，0.2 um尼龙膜过滤装置；真空泵；聚丙烯自动进样器小瓶；离心管（1.5ml）。 链霉素A（链霉素硫酸盐，美国药典准参考物质）试剂均购于Sigma-Aldrich。Bacto YPD Broth(Pfizer Consumer Healthcare, BD Laboratories, Cat# 0428-17-5)。标准溶液均由1000mg/L的贮备液（置于-40冰箱中）稀释配制，溶液均用18.2M.cm 的二次去离子水配制。 1.2 色谱条件色谱柱：CarboPac PA1 分析柱，4 x 250 mm，CarboPac PA1保护柱；流速：0.5 mL/min；进样体积：20 uL；温度：柱温30 C，检测器温度25 C；检测器（ED50）：脉冲安培检测器，AAA-Direct，一次性金电极，参比电极为pH模式；淋洗液通道A：水，淋洗液通道B：250mMNaOH。 等度程序：分离的淋洗液浓度70 mM NaOH；梯度程序：0-22 min 70mM NaOH, 22-40 min 200 mM NaOH; 40-60min 70mM NaOH。 1.3 系统适应性样品制备热降解链霉素A会产生一系列的产物，但是单一主组分可用于确认色谱系统的分离度是否符合系统适应性实验。主降解峰和链霉素A的分离度要大于3。准备系统适应性实验，可在密封的玻璃瓶中放置1ml 30g/mL 链霉素B，加热1小时。不要使用塑料的管子。 表1 链霉素A检测电位1.4链霉素和双氢二链霉素降解研究评价链霉素和双氢二链霉素的杂质随时间的变化是通过将样品的温度提高。在水中溶解41链霉素和双氢二链霉至少，加热至75，加热时间分别为0，60min以及24h。评价处理样品中杂质含量的变化。 图3.采用70mM NaOH分析USP和商品化链霉素硫酸盐的对比图1.5 YPD Broth Media样品前处理溶解1.0g YPD 发酵液到20mL过滤的去离子水中。以16000r/min的速度离心10min,然后稀释1000倍。回收率测定，加链霉素浓缩液到上清液中，然后稀释至样品中加入标样的浓度为10。上清液直接进样分析。 2结果与讨论 2.1分离 图2是采用CarbonPac PA1柱，70mM NaOH为流动相分析10 USP纯链霉素A（峰8）以及柱死体积的色谱图。链霉素A与其杂质的分离取决于淋洗液的浓度。表上为淋洗液浓度与链霉素A保留时间的影响关系图。在淋洗液50-77之间，淋洗液浓度的变化对出峰时间的影响最大。图3比较了以63 mM NaOH和70mM NaOH为淋洗液分析谱图对比。虽然采用63mMNaOH，杂质峰的分离度变大，但是分析速度变慢而且峰拖尾长。70mM NaOH为流动相的分离度可以达到分析的需求。杂质峰的出峰时间为8min(图3，色谱A,峰12)，主要的杂质峰为链霉菌二糖胺。图4为采用70mM NaOH分析10 USP链霉素硫酸盐和其它商业化产品中杂质的含量的对图。色谱A中的杂质谱图与色谱图B中的杂质谱图有明显地区别。表2 淋洗液浓度对链霉素A出峰时间的影响如图所示，链霉素A的与其它系统适应性色谱峰的分离度在一天内的范围5.46-6.14,符合分离度大于3的要求。而不称度因子的值为1.23-1.25符合不对称度2的要求；理论塔板素为2209-2227，亦满足10000的要求。通过热降解产生的链霉素A系统适应性的色谱的出峰时间大约在160min（采用70mM NaOH），为了避免此色谱峰对下一针样品分析产生干扰，在淋洗液的程序中可采用200mM NaOH进行清洗。具体的色谱图如图6所示。图4.保留时间长的色谱峰2.2方法的线性范围、精密度和最低检测限 在0.4 pmol-40nmol的浓度区别范围内考察线性，在本文的实验中发现最优的响应区间范围为120-400pmol。链霉素A的峰面积对浓度的平均响应因子为0.04470.0006nCmin/pmol。在浓度在4-200M的浓度范围区别内，标准曲线的相关系数（r2）的值为0.9976。基线，峰-峰的噪音通过空白运行的1min的范围内。基线噪音的值为9.8-194 pC。最低检出限计算是通过3倍的平均噪音除以抗生素的峰高-浓度响应因子。定量限的计算是通过10倍的平均噪音除以抗生素的峰高-浓度响应因子。链霉素A检出限的值为1.71.4pmol;而定量限的值为5.64.5 pmol,具体的数据如表2所示。考察方法的稳定性是通过测定连续34针同一样品的各指数的相对标准偏差RSD。具体的数据如表功所示。 图5. 检测YPD发酵液中的链霉素A2.2 样品测定和回收率测定 使用前面所说的色谱条件对真实样品中的链霉素及其杂质进行测定。通过对比样品色谱图与标准溶液的保留时间进行定性。此样品分析的难点在于样品基体的干扰，这与样品的前处理方法息息相关。在本文中，通过在稀释1000倍的确YPD broth中加标10-41M标样。分别加标10-41M，加标回收率分别为82.60.6%和92.90.6%，符合分析测试的要求。 3结论 HPAE-PAD（高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法）可有效分析链霉素A及杂质。此方法准确，重现性好，数据可靠性高，完全符合美国药典系统适应性数据测定的要求。采用HPAE-PAD方法分析，无需时耗时，耗力的样品衍生反应。总而言之，所描述的方法灵敏度高，峰面积好，保留时间的重现性优越而且分析速度快。 表3链霉素A的检出限及线性参考文献 1. Electronic Orange Book. Approved Drug Products with Therapeutic Equivalence Evaluations. U.S.Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Office of Pharmaceutical Science, Office of Generic Drugs. Current through February, 2007 2. United States Pharmacopeia, The National Formulary.“Streptomycin Sulfate.” USP 30, NF 25; Volume 3, 2007; p. 3222. 3. United States Pharmacopeia, Pharmacopeial Forum, Streptomycin for Injection, 2002; 28 (1) 8688. 4. Bruton, J.; Horner, W.H. Biosynthesis of Streptomycin:III. Origin of the Carbon Atoms of Streptose.J. Biol. Chem. 1966, 241, 31423146. 5.Demain, A.L.; Inamine, E. Biochemistry and Regulation of Strepto