纯钛表面淫羊藿苷 TiO2纳米管复合涂层制备与药物早期释放的分析.doc

www.CRTER.org王非凡，等. 纯钛表面淫羊藿苷/TiO2纳米管复合涂层制备与药物早期释放的分析纯钛表面淫羊藿苷/TiO2纳米管复合涂层制备与药物早期释放的分析王非凡1，宋云嘉1，吴文孟1，2，吕武龙1，李 莺1，李长义1(1天津医科大学口腔医学院，天津市 300070；2越南太平医科大学，越南太平省 33000)引用本文：王非凡，宋云嘉，吴文孟，吕武龙，李莺，李长义. 纯钛表面淫羊藿苷/TiO2纳米管复合涂层制备与药物早期释放的分析J.中国组织工程研究，2016，20(43):6416-6423.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.43.005 ORCID: 0000-0003-2314-9599(李莺)文章快速阅读：纯钛表面淫羊藿苷/TiO2纳米管复合涂层的制备王非凡，女，1991年生，天津市人，汉族，天津医科大学口腔医学院在读硕士，主要从事口腔种植材料研究。并列第一作者：宋云嘉，男，1990年生，天津市人，汉族，天津医科大学口腔医学院在读硕士，主要从事口腔种植材料研究。通讯作者：李莺，博士，副主任医师，天津医科大学口腔医学院，天津市300070中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)43-06416-08稿件接受：2016-07-23采用阳极氧化在光滑纯钛表面形成TiO2纳米管结果表明，淫羊藿苷/TiO2纳米管复合涂层可提供较高的药物加载量并具有缓释功能使用高效液相色谱法测定两种材料的早期药物释放量，计算出载药量，绘制累积释放量曲线和累计药物释放量百分比曲线扫描电镜、原子力显微镜、接触角测定仪对光滑纯钛及TiO2纳米管进行表征通过浸泡法在纯钛及TiO2纳米管表面加载淫羊藿苷文题释义：TiO2纳米管：具有很好的机械、化学性质及生物相容性，不仅可促进成骨细胞和骨髓间充质干细胞的黏附、增殖和骨向分化，还可吸附并容纳药物，是一种优良的局部药物载体。现有研究主要集中于在纳米管表面加载抗菌药物或活性成分形成复合涂层，而纳米管表面加载成骨类药物的报道相对较少。淫羊藿苷：价格低廉、性质稳定，不但可刺激骨髓间充质干细胞中成骨转化因子的活性，诱导干细胞向成骨细胞转化，还可有效增强成骨功能性标志物的表达：促进骨钙素分泌，提高碱性磷酸酶活性，刺激型胶原和成骨细胞特异性转录因子合成等，进而促进成骨细胞的分化和矿化。摘要背景：对纯钛进行表面改性，提高钛种植体早期骨结合能力是目前研究的热点。目的：在TiO2纳米管表面加载淫羊藿苷形成复合涂层，研究其载药量及早期释放规律。方法：通过阳极氧化在光滑纯钛表面形成TiO2纳米管，用扫描电镜、原子力显微镜、接触角测定仪对光滑纯钛及TiO2纳米管进行表征。通过浸泡法在纯钛及TiO2纳米管表面加载淫羊藿苷，使用高效液相色谱法测定两种材料的早期药物释放量，计算出载药量，绘制累积释放量曲线和累计药物释放量百分比曲线。结果与结论：TiO2纳米管径为80 nm，其粗糙度大于纯钛(P 0.05)，接触角小于纯钛(P 0.05)；淫羊藿苷/TiO2纳米管组前14 d的累计药物释放量和前4 h的药物累积释放曲线明显高于淫羊藿苷/纯钛组；与淫羊藿苷/纯钛组相比，淫羊藿苷/TiO2纳米管组累计药物释放量百分比曲线更为平缓，释放时间更长；结果表明，淫羊藿苷/TiO2纳米管复合涂层可提供较高的药物加载量并具有缓释功能。关键词：生物材料；缓释材料；纯钛；TiO2纳米管；淫羊藿苷；骨结合；表征；载药；浸泡法；药物释放；缓释；国家自然科学基金 主题词：钛；纳米管；骨结合；组织工程基金资助：国家自然科学基金资助项目(31470920，81500886)；天津市自然科学基金资助项目(16JCYBJC28700)3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 Titanium dioxide nanotube composite coating: preparation and early drug-releaseWang Fei-fan1, Song Yun-jia1, Wu Wen-meng1, 2, Lv Wu-long1, Li Ying1, Li Chang-yi1 (1School of Stomatology, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; 2Taiping Medical University of Vietnam, Taiping 33000, Vietnam)AbstractBACKGROUND: The surface modification of pure titanium has become a hotspot for research on improving the early implant-osseointegration ability.OBJECTIVE: To construct the icariin/TiO2 nanotube composite coating, and to explore its drug-loading rate and early drug-release kinetics.METHODS: Pure titanium was anodized to obtain TiO2 nanotube. Thereafter, the pure titanium and TiO2 nanotube were characterized by scanning electron microscopy, atomic force microscopy and contact angle instrument. Icariin was loaded onto the pure titanium and TiO2 nanotube by immersion method. Afterwards, the early drug-releasing amount of the two materials was measured using high-performance liquid chromatography. Accumulated release and accumulated drug-release percentage curves were drawn.RESULTS AND CONCLUSION: The diameter of TiO2 nanotube was 80 nm, and the roughness of TiO2 nanotube was significantly higher than that of pure titanium (P 0.05), but the contact angle was significantly lower than that of pure titanium (P 0.05). Moreover, compared with the icariin/pure titanium group, the icariin/TiO2 nanotube group had obviously higher accumulated drug-releasing amount at former 14 days and accumulated drug-releasing carve at former 4 hours. The accumulated drug-releasing percentage curve in the icariin/TiO2 nanotube group was flatter than that in the icariin/pure titanium group, suggesting a longer release time. To conclude, the icariin/TiO2 nanotube composite coating has a higher drug, loading and exerts better sustained-release effect.Subject headings: Titanium; Nanotubes; Synostosis; Tissue EngineeringFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 31470920, 81500886; the Natural Science Foundation of Tianjin, No. 16JCYBJC28700Cite this article: Wang FF, Song YJ, Wu WM, Lv WL, Li Y, Li CY. Titanium dioxide nanotube composite coating: preparation and early drug-release. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(43):6416-6423.Wang Fei-fan, Studying for masters degree, School of Stomatology, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, ChinaSong Yun-jia, Studying for masters degree, School of Stomatology, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, ChinaWang Fei-fan and Song Yun-jia contributed equally to this work.Corresponding author:Li Ying, M.D., Associate chief physician, School of Stomatology, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China6419ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction钛因其优良的机械强度、抗腐蚀性及生物相容性成为种植体的首选材料。但钛金属为生物惰性材料，无法与周围组织直接形成良好的早期骨结合1。此外，一些代谢性疾病可减慢种植体骨结合进程，进而导致种植体置入失败2。因此，对钛进行表面改性，提高种植体早期骨结合能力是学者们研究的热点。目前对钛种植体材料进行表面改性的方法主要有机械法(喷砂法3、激光涂覆法4)、化学法(酸蚀5)、阳极氧化法及涂层修饰法6-7。其中，机械法、化学法虽可在纯钛表面形成利于骨结合的超微型结构及化学表面，然而不能形成可控的表面形貌，并且易在操作中产生残留物，进而可能影响成骨细胞及骨髓间充质干细胞的黏附、增殖、分化等功能。阳极氧化法克服了上述不足，可在表面形成均一、可控的TiO2纳米管表面形貌。此外，TiO2纳米管构与人体骨组织相近，不仅具有很好生物相容性，而且其较高的比表面积还可有效促进成骨细胞和骨髓间充质干细胞的黏附攀爬和生长分化8-9。涂层修饰法是在纯钛表面加载具有成骨作用的生物、化学分子或药物形成涂层，促进种植体周围的骨结合能力。然而涂层与纯钛表面结合强度较差，易脱落，进而影响其发挥成骨效应。在成骨类药物中，淫羊藿苷是一种很有应用前景的中药，能调节多条信号通路促进成骨，抑制骨破坏10-11，在体内前成骨细胞培养条件下和体外骨质疏松动物模型中均具有明确的骨诱导作用12-13。将淫羊藿苷负载在种植体表面，有望加快种植体的早期骨结合过程。实验的创新性在于，充分利用TiO2纳米管优良的成骨特性和吸附容纳药物的管状结构14，将TiO2纳米管作为载体，在TiO2纳米管表面加载成骨类药物，形成淫羊藿苷/TiO2纳米管复合涂层，不仅使成骨药物淫羊藿苷因TiO2纳米管的承载约束而加载牢固，还可综合TiO2纳米管及淫羊藿苷的促成骨特性，有效地协同促进种植体周围骨形成。目前，随着种植体载药涂层的研究逐渐深入，药物释放性能受到了越来越广泛关注。种植后骨结合是持续过程，需要种植体载药涂层缓释药物，提供足量的药物浓度至种植体周围组织15。因此，测试淫羊藿苷/TiO2纳米管复合涂层的药物加载量，研究其缓释规律是研究其早期骨诱导作用的关键。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 随机分组设计，对比观察实验。1.2 时间及地点 材料制备于2015年4至6月在天津医科大学口腔医学院中心实验室完成，材料表征于2015年7至8月在河北省新型功能材料重点实验室完成，药物释放于2015年8至10月在天津医科大学药理学教研室完成。1.3 材料淫羊藿苷/TiO2纳米管复合涂层制备实验用主要材料及设备：材料及设备来源纯钛西北有色金属研究院淫羊藿苷Sigma 公司，美国高压直流电源天津市东文高压电源厂电磁搅拌仪江苏金坛城西晓阳电子设备厂铂电极天津艾达恒晟科技发展有限公司扫描电镜Hitachi 公司，日本原子力显微镜Agilent公司，美国接触角测定仪厦门崇达智能科技有限公司，中国高效液相色谱仪Agilent公司，美国1.4 实验方法 纯钛的预处理：将40枚直径1.5 cm的圆钛片逐级用碳化硅砂纸进行序列打磨抛光至600目。抛光完成后依次用丙酮、无水乙醇及去离子水进行10 min超声清洗，自然干燥，将处理后的试样随机分为纯钛组和TiO2纳米管组，每组20枚。 TiO2纳米管试样的制备：将试样与阳极相连，铂与阴极相连，放入0.34% HF电解液中，置于电磁搅拌仪中持续搅拌。在高压直流电源18 V电压条件下进行 40 min阳极氧化处理，在试样表面生成TiO2纳米管。制备完成后去离子水进行超声清洗20 s，干燥后备用。 扫描电镜观察：在纯钛组和TiO2纳米管组中各随机选择5枚，通过溅射镀膜在试样表面形成一层薄的金钯膜，在5 kV的加速电压下应用扫描电镜采集并记录试样的表面形貌。 原子力显微镜检测：采用原子力显微镜对两组试样的三维结构及纳米粗糙度进行表征。在两组试样中各随机选择10枚，在11 m2扫描区域，采用纳米探头以2 Hz的扫描速度与样品进行接触检测，取平均值。 接触角检测：在两组试样中各随机选择5枚，在距离试样表面5 cm的位置滴加10 L去离子水，通过接触角测定仪测量去离子水在试样表面的接触角，以此反映试样的亲水性，每个试样测10次，取平均值。 材料表面加载淫羊藿苷：纯钛是公认的生物安全性极好的生物材料，被认为不具有细胞毒性而广泛应用于口腔种植领域1。而作为人体置入材料，需要考虑淫羊藿苷的细胞毒性问题。研究预实验提示：10-5- 10-9 mol/mL的淫羊藿苷溶液对成骨细胞和骨髓间充质干细胞未表现出明显的细胞毒性，与以往研究结果相吻合16-17。预实验还测定了在210-3 mol/mL淫羊藿苷中浸泡所形成的淫羊藿苷/TiO2纳米管复合涂层的释放过程浓度，得出在整个释放过程中，从1-14 d，淫羊藿苷浓度值范围在10-5-10-8 mol/mL之间。因此研究选用210-3 mol/mL浓度，采用浸泡法加载淫羊藿苷，制备出的淫羊藿苷/TiO2纳米管复合涂层。研究采用DMSO溶液将淫羊藿苷配制成 210-3 mol/mL的溶液，将两组各5个试件分别放入淫羊藿苷溶液中浸泡3 d，然后在空气中干燥1 d。随后用移液管吸取500 L PBS快速冲洗表面，移除未与光滑钛片及TiO2纳米管牢固结合的多余淫羊藿苷，分别制成淫羊藿苷/纯钛组和淫羊藿苷/TiO2纳米管组。淫羊藿苷加载量和早期释放规律检测：将冲洗后的淫羊藿苷/纯钛组和负载淫羊藿苷/TiO2纳米管组试样放入24孔板中，分别用500 L PBS浸泡，置于50 r/min的水浴(37 )摇床上。在前4 h内，每隔1 h吸出浸泡液并加入500 L新鲜PBS，用高效液相色谱法检测浸泡液淫羊藿苷浓度。随后将测量时间间隔延长到1 d，直到所有的淫羊藿苷释放到PBS中，计算不同时间点释放剂量的平均值，计算加载量，绘制累计释放量曲线和累计释放百分比曲线。1.5 主要观察指标 两组试样表面扫描电镜、原子力显微镜、接触角检测结果，以及淫羊藿苷加载量和早期释放规律。1.6 统计学分析 使用SPSS 12.0软件进行配对t 检验，P 0.05时提示差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 扫描电镜观察结果 光滑纯钛试样表面没有特殊的结构，见图1A；而阳极氧化后TiO2纳米管试样表面形成了均匀而垂直排列的管状结构，管径大致为80 nm，管壁厚度约为10 nm，管间隙约为10 nm，见图1B。 2.2 原子力显微镜观察结果 图2为原子力显微镜的三维立体图，可见纯钛组表面仅可见机械打磨的划痕，见图2A；TiO2纳米管组表面为凹凸分布的纳米级结构，见图2B。分析得出，纯钛组粗糙度是183.413.8，TiO2纳米管组粗糙度是424.620.4，组间比较差异有显著性意义(P 0.05)。2.3 接触角检测结果分析 经过接触角检测，纯钛组为(46.35.4)，TiO2纳米管组接触角为(15.84.2)，组间比较差异有显著性意义(P 0.05)，TiO2纳米管组亲水性大于纯钛组。2.4 淫羊藿苷加载量和早期释放规律检测结果分析 图3为淫羊藿苷/纯钛组和淫羊藿苷/TiO2纳米管组在前14 d及前4 h的淫羊藿苷累积释放曲线。图3A显示，淫羊藿苷/TiO2纳米管组药物累积释放曲线高于淫羊藿苷/纯钛组，经计算，前14 d淫羊藿苷/TiO2纳米管组药物累积释放量为14.68 g，淫羊藿苷/纯钛组为6.85 g，淫羊藿苷/TiO2纳米管组的载药量约为淫羊藿苷/纯钛组的2倍。此外，两组药物释放曲线趋势相近，可分为快速释放阶段和慢速释放阶段，前4 h为快速释放阶段，两组试样的释放量显著较高，淫羊藿苷/TiO2纳米管组在前4 h中具有持续较高的释放量，而淫羊藿苷/纯钛组的释放量相对不稳定，在1 h释放量较多，随后明显下降(图3B)；在慢速释放阶段，两组均呈现线性少量释放，然而淫羊藿苷/TiO2纳米管组与淫羊藿苷/纯钛组相比具有更高更稳定的药物释放量(图3A)。图4为两组在前14 d及前4 h的淫羊藿苷累积释放百分比曲线。由图4A可以看到，与淫羊藿苷/纯钛组相比，淫羊藿苷/TiO2纳米管组累积释放百分比曲线更为平缓，提示药物释放速度较慢，具有缓释药物的能力。以上特征在快速释放阶段(图4B)表现得更加明显，淫羊藿苷/TiO2纳米管组在前4 h的累积释放百分比较低且释放更为缓慢持续；在慢速释放阶段，淫羊藿苷/TiO2纳米管组药物缓释一直持续到第9天，长于淫羊藿苷/纯钛组的5 d(图4A)。3 讨论 Discussion3.1 淫羊藿苷/TiO2纳米管复合涂层的制备 牙科种植手术成功的标志是在骨组织与种植体界面形成良好的骨结合18，然而，钛材质的种植体生物活性较低，置入人体后骨整合时间较长，特别是一些代谢性疾病如糖尿病、骨质疏松症可引起骨结构异常和代谢异常，干扰种植体的早期骨结合，因此促进种植体周围成骨是种植术后的关键问题19-20。TiO2纳米管具有很好的机械、化学性质及生物相容性21-24，不仅可促进成骨细胞和骨髓间充质干细胞的黏附、增殖和骨向分化25-28，还可吸附并容纳药物，是一种优良的局部药物载体。现有研究主要集中于在纳米管表面加载抗菌药物或活性成分形成复合涂层29-32，而纳米管表面加载成骨类药物的报道相对较少33。淫羊藿苷价格低廉、性质稳定，不但可刺激骨髓间充质干细胞中成骨转化因子的活性，诱导干细胞向成骨细胞转化34-35，还可有效增强成骨功能性标志物的表达：促进骨钙素分泌，提高碱性磷酸酶活性，刺激型胶原和成骨细胞特异性转录因子合成等，进而促进成骨细胞的分化和矿化36-37。研究将淫羊藿苷加载至TiO2纳米管，制备淫羊藿苷/TiO2纳米管复合涂层，使该药物与TiO2纳米管自身的成骨效应协同，进一步加快种植体的早期骨结合过程。 以往研究表明，直径为80 nm的TiO2纳米管具有更强的亲水性，促进成骨细胞及骨髓间充质干细胞黏附效果更佳，成骨作用更强38-39。因此，研究通过预实验摸索并调整阳极氧化参数，制备出直径为80 nm的TiO2纳米管。药物加载方法中，浸泡法与化学偶联法或滴覆法相比，操作简单有效，减少样本被污染的风险40-42。前期实验发现，在高浓度浸泡液(210-3 mol/mL)中浸泡后所形成的TiO2纳米管载药复合涂层，较之低浓度浸泡液(110-3 mol/mL)中浸泡后所形成的涂层药物加载量较多且分布均匀，药物释放时间延长。因此研究应用浓度为210-3 mol/mL的淫羊藿苷浸泡液加载药物。此外，研究采用原子力显微镜和接触角检测，结果显示：TiO2纳米管具有更高的粗糙度、更高的亲水性，故TiO2纳米管可使药物溶液更为均匀地铺展并吸附到试样表面，具有较高的药物加载效率。3.2 淫羊藿苷/TiO2纳米管复合涂层的药物加载量及早期释放规律研究 淫羊藿苷具有优良的骨诱导及成骨特性，然而其生物利用度及半衰期较短，半衰期为1.0-2.0 h43，因此需要增加淫羊藿苷的加载量及延长淫羊藿苷的释放时间，改善生物利用度，更好地发挥其促进成骨的作用。以往有关种植体载药复合涂层的研究表明：相对于光滑纯钛表面，种植体载药涂层具有较大的载药量，并在种植后缓释药物，可以给周围组织提供持续足量的药物释放44。实验检测淫羊藿苷/TiO2纳米管复合涂层的药物早期释放量，计算其药物加载量，分析早期释放规律，结果显示：与光滑纯钛表面相比，TiO2纳米管可提供更高的药物释放浓度，具有更大的载药量，并且释放速度减慢，具有缓释效果。该结果与以往纳米管载药复合涂层的研究结果相近。分析淫羊藿苷/TiO2纳米管复合涂层的载药机制，主要是由于TiO2纳米管的管状结构，可提供较大的表面积及体积来吸附更多的药物到其表层及内部45，有效增加药物加载量。其缓释效果归因于TiO2纳米管的管状结构可限制药物从其表面及管内释出46，减慢释药速度，延长释放时间。故可通过调整TiO2纳米管直径及长度来获得较大的载药量并缓释药物，为种植体周围组织提供持6423ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH累积释放百分比(%)图4 淫羊藿苷/纯钛组及淫羊藿苷/TiO2纳米管组淫羊藿苷累积释放百分比曲线Figure 4 Accumulated drug-release percentage curves of icariin/pure titanium group and icariin/titanium dioxide nanotube group图注：图中A为前14 d累积释放百分比曲线，淫羊藿苷/TiO2纳米管组累积释放百分比曲线相比淫羊藿苷/纯钛组更为平缓，淫羊藿苷/TiO2纳米管组累积药物释放时间为9 d，而淫羊藿苷/纯钛组为5 d；图B为前4 h累积释放百分比曲线，与淫羊藿苷/纯钛组相比，淫羊藿苷/TiO2纳米管组曲线更为缓慢持续。B淫羊藿苷/纯钛组淫羊藿苷/TiO2纳米管组时间(h)0 1 2 3 4100806040200时间(d)淫羊藿苷/纯钛组淫羊藿苷/TiO2纳米管组0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 13 14A累积释放百分比(%)100806040200BA图3 淫羊藿苷/纯钛组和淫羊藿苷/TiO2纳米管组淫羊藿苷累积释放量曲线Figure 3 Accumulated release amount curves of the icariin/pure titanium group and icariin/titanium dioxide nanotube group图注：图中A为前14 d累积释放量曲线，淫羊藿苷/TiO2纳米管组药物累积释放曲线高于淫羊藿苷/纯钛组；B为前4 h累积释放量曲线，淫羊藿苷/TiO2纳米管组具有持续较高的释放量，而淫羊藿苷/纯钛组释放量相对不稳定。时间(h)时间(d)0 1 2 3 4纯钛组TiO2纳米管组累积释放量(g钛组TiO2纳米管组0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 13 14累积释放量(g)1614121086420图2 原子力显微镜观察两组试样表面形貌的三维结构Figure 2 Three-dimensional surface structure of the two materials under atomic force microscopy图注：图中A为纯钛组，可见机械打磨的划痕；B为TiO2纳米管组，可见凹凸分布的纳米级结构。BAB A图1 扫描电镜观察两组试样表面形貌(6 000)Figure 1 Surface morphology of the two materials under scanning electron microscop (6 000)图注：图中A为纯钛组，表面无特殊结构；B为TiO2纳米管组，表面为均匀排布的管状形貌。续较高药物浓度，进而增强早期骨结合能力。淫羊藿苷从TiO2纳米管中释放可分为2个阶段：前4 h的早期快速大量释放阶段和随后9 d的后期慢速微量释放阶段。在快速释放阶段，TiO2纳米管表层疏松结合的药物依靠与PBS的浓度梯度，通过物理吸附作用从TiO2纳米管表层快速大量地溶解释出，因而形成了早期的药物快速大量释放期。在随后的慢速释放阶段，加载在TiO2纳米管深层的药物凭借扩散作用从管内释放出来47，因此在此阶段药物呈现微量持续缓慢释放的特征。在快速释放阶段，淫羊藿苷/TiO2纳米管复合涂层对于种植体骨结合的影响分为2个方面。一方面，涂层中的淫羊藿苷的快速大量释放可在早期(4 h)为种植体周围组织提供持续较高的药物释放，使得淫羊藿苷在早期对骨髓间充质干细胞发挥骨诱导作用，促进骨髓间充质干细胞的增殖并诱导其向成骨细胞分化48-49。研究表明，淫羊藿苷可降低自噬小体的数量和哺乳动物微管相关蛋白1轻链3-(mammalian microtubule-associated protein-1 light chain 3，LC3-)的水平50；骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的初期(前3-6 h)可见LC3-的水平锐减和自噬小体的快速降解51，因而骨髓间充质干细胞可通过降低初期自噬小体的数量和LC3-水平而促进骨髓间充质干细胞向成骨方向分化。因此，淫羊藿苷/TiO2纳米管复合涂层在前4 h大量快速释放淫羊藿苷，可降低自噬小体的数量和LC3-的水平，进而发挥早期骨诱导作用。此外，骨髓间充质干细胞成骨分化的初期(前3-6 h)是整个成骨分化的关键窗口期，增强骨髓间充质干细胞早期成骨分化还可有效促进后期成骨分化51-52。另一方面，涂层中的TiO2纳米管结构，在早期具有促进骨髓间充质干细胞和成骨细胞在种植材料表面的黏附和铺展的作用28，53-54。而早期的细胞黏附可形成细胞骨架和焦点黏附，介导跨膜信号传导，进而激活后续调节基因表达，启动后期的细胞生长、分化等活动55-56。研究表明，骨再生区的骨髓间充质干细胞来源广泛，可来源于其周围组织(软组织、骨髓)以及全身周围组织57；研究还发现，材料表面的纳米级结构可加快全身周围来源的骨髓间充质干细胞在早期募集到种植体周围58。因而可以推测，淫羊藿苷/TiO2纳米管复合涂层种植体在置入颌骨部位后首先直接与周围的软组织、骨髓中的干细胞相接触，随后又可通过纳米级结构和淫羊藿苷的的诱导作用，进一步募集骨髓间充质干细胞到受植区周围。综上可知，在快速释放阶段，淫羊藿苷/TiO2纳米管涂层快速大量释放的淫羊藿苷，可发挥对骨髓间充质干细胞骨诱导作用，纳米管表面结构在早期可促进骨髓间充质细胞和成骨细胞的黏附，两者在快速释放阶段可协同增强早期的成骨过程，并有望在骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的后期起到有效的促进作用。在慢速释放阶段，虽然TiO2纳米管药物释放速度较慢，但与光滑纯钛表面载药相比，药物释放量更多，并具有缓释效果，药物释放时间一直可以持续到第9天。有研究表明，当淫羊藿苷持续作用于成骨细胞7 d后，具有明确的促成骨细胞分化及矿化的作用37，59。与此同时，TiO2纳米管还具有促进成骨细胞增殖与分化的作用25-26。故淫羊藿苷/TiO2纳米管复合涂层在后期仍可以相互协同，共同促进慢速释放阶段的早期成骨作用，以促进早期骨结合。综上所述，淫羊藿苷/TiO2纳米管复合涂层通过在纳米管表面加载具有成骨特性的药物，可分别在快速释放阶段和慢速释放阶段实现协同作用，促进种植体早期骨诱导作用。与光滑表面直接加载淫羊藿苷的载药方法相比，该涂层制备方法简单，载药量更大，可提供持续较高的药物释放量，并具有早期缓释功能，进而促进早期骨结合，具有良好的应用前景。致谢：衷心感谢天津医科大学口腔医学院中心实验室张凯老师，天津医科大学药理学教研室焦建杰老师，为研究的完成提供良好的实验条件。作者贡献：实验设计、实施及评估由第一作者和共同第一作者共同完成，资料收集由第三作者完成，数据处理为第四作者完成，成文为第一作者。利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：未涉及伦理冲突的内容。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家审核，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者和共同第一作者对于研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 Portan DV,Kroustalli AA,Deligianni DD,et al.On the biocompatibility between TiO2 nanotubes layer and human osteoblasts.J Biomed Mater Res A. 2012;100 (10):2546-2553.2 Javed F,Romanos GE.Impact of diabetes mellitus and glycemic control on the osseointegration of dental implants: a systematic literature review.J Periodontol. 2009;80(11):1719-1730.3 Cochran DL,Jackson JM,Bernard JP,et al.A 5-year prospective multicenter study of early loaded titanium implants with a sandblasted and acid-etched surface. Int J Oral Maxillofac Implants.2011;26(6):1324-1332.4 Faeda RS,Tavares HS,Sartori R,et al.Evaluation of titanium implants with surface modification by laser beam. Biomechanical study in rabbit tibias.Braz Oral Res. 2009;23(2):137-143.5 吴明月,周玉琴,李全利,等.钛种植体表面磷酸化与仿生矿化的实验研究J.中华口腔医学杂志, 2012,47(6): 354-358.6 Chellappa M,Anjaneyulu U,Manivasagam G,et al.Preparation and evaluation of the cytotoxic nature of TiO2 nanoparticles by direct contact method.Int J Nanomedicine.2015;10 Suppl 1:31-41.7 徐倩,冯青,欧俊,等.层层静电自组装构建载药种植体的研究J.华西口腔医学杂志, 2014,32(6):537-541.8 Das K,Bose S,Bandyopadhyay A.TiO2 nanotubes on Ti: Influence of nanoscale morphology on bone cell-materials interaction.J Biomed Mater Res A. 2009; 90(1):225-237.9 Brammer KS,Oh S,Cobb CJ,et al.Improved bone-forming functionality on diameter controlled TiO2 nanotube surface.Acta Biomater. 2009;5(8): 3215-3223.10 Song L,Zhao J,Zhang X,et al.Icariin induces osteoblast proliferation, differentiation and mineralization through estrogen receptor-mediated ERK and JNK signal activation.Eur J Pharmacol.2013;714(1-3):15-22.11 Xu CQ,Liu BJ,Wu JF,et al.Icariin attenuates LPS-induced acute inflammatory responses: Involvement of PI3K/Akt and NF-kappaB signaling pathway.Eur J Pharmacol.2010;642(1-3):146-153.12 Zhao J,Ohba S,Komiyama Y,et al.Icariin: a potential osteoinductive compound for bone tissue engineering.Tissue Eng.2010;16(1):233-243.13 Luo Z,Liu M,Sun L,et al.Icariin recovers the osteogenic differentiation and bone formation of bone marrow stromal cells from a rat model of estrogen deficiency-induced osteoporosis.Mol Med Rep.2015; 12(1):382-388.14 Gulati K,Ramakrishnan S,Aw MS,et al.Biocompatible polymer coating of titania nanotube arrays for improved drug elution and osteoblast adhesion.Acta Biomater. 2012;8(1):449-456.15 Liu X,Li X,Li S,et al.An in vitro study of a titanium surface modified by simvastatin-loaded titania nanotubes-micelles.J Biomed Nanotechnol. 2014; 10(2):194-204.16 Zhao J,Ohba S,Shinkai M,et al.Icariin induces osteogenic differentiation in vitro in a BMP- and Runx2-dependent manner.Biochem Biophys Res Commun.2008;369(2):444-448. 17 Zhang X,Guo Y,Li DX,et al.The effect of loading icariin on biocompatibility and bioactivity of porous -TCP ceramic.J Mater Sci Mater Med.2011;22(2):371-379.18 Geetha M,Singh AK,Asokamani R,et al.Ti based biomaterials, the ultimate choice for orthopaedic implantsA review.Prog Mater Sci.2009;54:397-425.19 Beppu K,Kido H,Watazu A,et al.Peri-implant bone density in senile osteoporosis-changes from implant placement to osseointegration.Clin Implant Dent Relat Res.2013;15(2):217-226.20 Alghamdi HS,Jansen JA.Bone regeneration associated with nontherapeutic and therapeutic surface coatings for dental implants in osteoporosis. Tissue Eng Part B Rev. 2013;19(3):233-253.21 Macak JM,Tsuehiya H,Schmuki P.High-aspect-ratio TiO2 nanotubes by anodization of titanium. Angew Chem Int Ed Engl.2009;44(14):2100-2102. 22 Oh S,Brammer KS,Li YS,et al.Stem cell fate dictated solely by altered nanotube dimension.Proc Natl Acad Sci USA.2009;106(7):2130-2135. 23 Das K,Bose S,Bandyopadhyay A,et al.TiO2 nanotubes on Ti:Influence of nanoscale morphology on bone cell-materials interaction.J Biomed Mater Res A. 2009; 90(1):225-237. 24 Brammer KS,Oh S,Cobb CJ,et al.Improved bone-forming functionality on diameter controlled TiO2 nanotube surface.Acta Biomater.2009;5(8):3215-3223.25 于卫强,蒋欣泉,张益琳,等.TiO2纳米管的制备及其对成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响J.中华口腔医学杂志,2009,44(12):751-755.26 Kim JH,Cho KP,Chung YS,et al.The effect of nanotubular titanium surfaces on osteoblast differentiation.J Nanosci Nanotechnol. 2010;10(5): 3581-3585.27 Peng Z,Ni J,Zheng K,et al.Dual effects and mechanism of TiO2 nanotube arrays in reducing bacterial colonization and enhancing C3H10T1/2 cell adhesion. Int J Nanomedicine.2013;8:3093-3105. 28 Yu WQ,Xu L,Zheng K,et al.The effect of Ti anodized nano-foveolae structure on pr