毕业论文开题报告-王晶.doc

开 题 报 告Streptomyces thiolactonusNRRL15439中负调控基因orf5670的发现和生物学功能研究 学院：_药学院_学号：_2011302290028_ 姓名：_王晶_一、 论文选题的目的和意义通过实验研究发现在S.thiolactonusNRRL15439里发现了一个负调控基因orf5670，异源表达及在原来宿主体内过表达发现能够抑制一些次级代谢产物的合成，主要是发现平板上色素合成被抑制住，同时我们对基因组进行分析发现，该基因位于一个可能的基因簇内部，设计在体内敲除该基因看能否激活基因簇的表达。耐药病原微生物和各种新型传染病的不断出现,迫使人们不断寻求新的药物。天然产物一直是新药发现的源泉,其中放线菌尤其是链霉菌产生的次级代谢产物是抗生素和其它药物的主要来源。基因组测序数据显示微生物中含有大量的次级代谢基因簇,其编码次级代谢产物的合成潜力远超过已发现代谢产物的数量,其中大部分次级代谢基因簇是沉默或低表达的,基因组挖掘的方法是发现这些基因簇代谢产物有力工具。随着微生物基因组测序项目开展,越来越多的沉默基因簇被发现。采用激活微生物沉默基因簇的方法,可以充分发掘微生物次级代谢的潜力并可以获得大量新结构天然产物,为新药发现提供更多天然化合物来源,对新药创制具有重要意义。链霉菌具有强大的次级代谢能力, 能够产生众多具有生物活性的次级代谢产物,如目前广泛应用的抗生素、抗肿瘤药物以及免疫抑制剂等。在链霉菌中, 次级代谢产物的生物合成受到包括途径特异性、多效性以及全局性调控基因在内的多层次严格调控。关键调控基因的缺失或过表达可以显著影响次级代谢产物的生物合成, 提示对于链霉菌次级代谢重要调控基因的功能及其作用机制的研究具有巨大的潜在应用价值。二、 国内外关于该论题的研究现状和发展趋势 链霉菌的基因组大小多在数Mb以上, 如2001年完成测序的天蓝色链霉菌基因组大小为8, 667, 507bp, 2003年完成测序的阿维链霉菌基因组大小为9, 025, 608bp, 均大于所有的其它细菌基因组, 而其基因数量(约7000以上)与真核生物的酵母(6000)和人类(31000)相差不大, 这些都为链霉菌适应复杂多变的环境和其复杂的次生代谢调控提供了充足的遗传信息。次级代谢一般是在营养耗尽,生物合成或添加诱导物以及生长率下降的生理状态下起始。通常认为,营养降低等环境因素的变化先激活一个“总基因”,这个总基因或者作用于稀有tRNA 的转录,或者编码一个正调控的转录因子,既调控次级代谢又调控形态分化,被称为全局性调控,是较高级别的调控,如多效性调节基因bldA 和多效性作用因子A2因子、cAMP 和pp Gpp 。较低级别的调控控制次级代谢或形态分化的一个分支,主要发生在级联反应中的途径特异性转录激活子上,这些转录激活子又是多效性调节基因和作用因子的作用靶位点。下面以抗生素合成的调控来介绍链霉菌次级代谢的调控机制及发展。(1)途径专一性调控由途径专一性调控因子作用的调控方式是抗生素调控中最常见的类型。例如:位于act基因簇中间的Act-ORF4,编码一个正调控因子调控部分或所有act合成基因的表达。Act-ORF4基因的突变,可以通过阻止act的转录,阻断所有其它水平的act突变株合成放线紫红素。有趣的是以低拷贝质粒为载体,额外增加一到两个拷贝的Act-ORF4就可以引起放线紫红素的高产。同样编码Red(十一烷基灵菌红素)生物合成途径专一性激活蛋白的redD基因也具有类似的功能。而且Act-ORF4和redD的产物氨基酸同源性非常高,所以它们可能是以相同的方式作用的。虽然在redD的N端附近可能有一个DNA结合区域,但是研究表明犷已已。的N端不会离那么远。因此仅根据Act-ORF4和RedD的氨基酸序列不能预测它们真正的功能将Act-ORF4引入波赛链霉菌同样能够刺激道诺霉素的高产。Dnrl和Act-ORF4功能的相似性可能与道诺霉素和放线紫红素具有相似结构有关。它们都是芳香族聚酮化合物,但是并不是所有的聚酮类抗生素都由Act-ORF4家族的某个成员调控的。例如:生二素链霉菌中的螺旋霉素是一种大环内酷类的聚酮化合物,它的调控基因srmR的产物还没发现同源物。（2）抗生素合成的全局调控各个不同的途径专一性调控因子的表达是否只是对生长受到限制的单独反应,还是存在着全局性的调控来控制抗生素的产生呢?遗传研究证明在抗生素的合成过程中确实存在着全局性调控方式。第一个例子是bdl突变,之所以这样命名是因为在特定的生长条件下这类突变菌株不能形成气生菌丝而呈现光秃(bald)的表型。在天蓝色链霉菌中有好几个bdl基因的座位己经被确定。大多数天蓝色链霉菌bdl突变株都不产生四种抗生素。第二个全局性调控的例子是:abs突变。这种突变菌株在次生代谢方面是缺陷的而形态分化基本没有受影响,如absA、absA、abaA、afsB完全不产生四种抗生素但是产抱正常。用紫外线和NTG进行诱变,筛选得到了十种不产生放线紫红素和十一烷基灵菌红素的突变株,进一步研究证明它们同时也不产次甲基霉素和钙依赖抗生素。遗传分析又将abs突变分为两类:一类命名为absA,在遗传图谱上位于10点钟处,另一类命名为absB,位于5点钟处。Hara等人在筛选A因子的缺陷菌株时还分离到了又一类受影响相对较小的ActRed突变株。而abaA的发现则是因为天蓝色链霉菌的一个多拷贝文库克隆可以刺激变铅青链霉菌产生放线紫红素。变铅青链霉菌和天蓝色链霉菌的同源性很高,并且在通常培养条件下可以产生少量或不产生放线紫红素。通过中断天蓝色链链霖菌分化负调节基因nsdA在抗生素高产育种上的应用霉菌中的abaA,得到了abaA的突变株。该突变株中放线紫红素、十一烷基灵菌红素和钙依赖抗生素都减产,而次甲基霉素的产生和形态分化并不受影响。absA、absB、abaA和afsB突变株的表型说明确实存在全局性抗生素合成调控机制,同时这些基因的发现又促使人们去筛选仅影响Act、Red、CDA或Mmy中的一种抗生素的合成而又可以正常进行形态分化的突变,从而最终阐明抗生素在形态分化中的真正作用。AbsA、absB、abaA和afsB是否直接调控抗生素合成基因的表达呢?Northem杂交显示afsB突变至少在一定条件下可以刺激act产生少量的mRNA。将多拷贝的act-ORF4和redD基因引入absA和absB突变株,可以引起相应抗生素的高产,这说明abs基因在抗生素合成基因的转录中起重要的作用,因为如果abs突变只是引起某种合成作用或代谢受限制的话,不会出现上述的情况。在abs突变株中不能合成放线紫红素或十一烷基灵菌红素的唯一原因也许只是不能产生足够有活性的Act一ORF4或RedD蛋白。另一种解释是:存在某种未知基因的产物在抗生素基因转录时与Act一ORF4或RedD相互作用,abs基因可能参与调控表达这个因子,而过量表达的Act一ORF4或RedD可以绕过对abs的依赖。(3)双组份调控双组份调控系统afsQ1-afsQ2和afsR-afsK是抗生素合成调控的另外一种方式。与absA一样afsQ1-afsQ2和afsR-afsK都是从天蓝色链霉菌中克隆到的,可以刺激变铅青链霉菌产生放线紫红素的基因,而它们对天蓝色链霉菌的作用报道不多,但是额外拷贝的叻尺可以刺激十一烷基灵菌红素的产生,对钙依赖抗生素和次甲基霉素的产生却没有影响。DNA序列分析表明,afsQ1、afsQ2分别是调控蛋白和感受蛋白,它们组成了原核生物中的一种非常具有代表性的双组份调控系统。afsQ1、afsQ2中任何一个被中断对抗生素的合成都没有影响,也afsQ1-afsQ2的功能对其它的抗生素调控因子来说是多余的或者它们需要在一种现在还未知的生长条件下才促使抗生素的产生。但是afsQ1确实可以互补absA突变菌株产生放线紫红素和十一烷基灵菌红素。在枯草芽抱杆菌和酿酒酵母中磷酸化级联系统己经被证明参与调控产抱。afsR的产物AfsR是一个抗生素合成基因的转录调控因子,而AfsK是结合在细胞膜上的激酶,它负责将AfsR磷酸化。和afsQ1-afsQ2不同的是,afsR、afsK都不是双组份调控系统的特异性蛋白,但是户AFSR N端的氨基酸序列与途径专一性激活蛋白家族包括Act-ORF4、RedD和Dnrl类似。其意义还不知道,也许这些蛋白之间存在着某种相互作用。尽管与Act一ORF4相似,AfsR还是不能代替Act一ORF4激活放线紫红素的表达。现在只知道afsR的中断会延迟放线紫红素的产生,并且产量减少。对其它几种抗生素的影响还不清楚。因为这里的中断还没有完全缺失afsR基因,至于afsR的哪一部分是抗生素调控所必需还不知道。更奇怪的是bialpahos的途径专一调控蛋白BrpA与双组份调控系统的感受蛋白类似,但是它们之间相互的关系还不清楚,因为BrpA没有保守的磷酸化位点,也没有一个蛋白激酶基因与brpA邻近。还有一点要提及的是真核生物的蛋白激酶的抑制剂可以同时抑制灰色链霉菌的次生代谢和气生菌丝的形成,而且这些抑制剂在体外还可以抑制蛋白的磷酸化。三、 论文的主攻方向、主要内容、研究方法及技术路线前期试验结果显示在S.thiolactonusNRRL15439里发现了一个负调控基因orf5670，orf5670能够负调节S. lividans TK24和S. thiolactonus NRLL15439在SFM固体平板上的色素合成能力；同时，生物信息学分析发现orf5670位于一个可能的次级代谢产物基因簇内，设计在体内敲除该基因看能否激活基因簇的表达。综上所诉，本课题设计在S. thiolactonus NRRL15439染色体上同框缺失编码负调控蛋白的orf5670，尝试激活新的天然产物的生物合成。为此我们设计了以下的研究方法与实验内容：（1）实验内容在老师和师姐的指导下，完成orf5670基因敲除载体的构建，然后基于该载体通过同源臂的同源重组将S.thiolactonus NRRL15439染色体上的orf5670基因同框敲除，最终对orf5670基因缺失突变菌株进行发酵检测。（2） 研究方法 基因转录水平检测：通过RT-PCR检测调控基因orf5670及邻近可能受其调控的次级代谢基因簇内基因的转录情况； orf5670在S. thiolactonus NRRL15439中过表达：对菌株NRRL15439:orf5670进行表型观察和发酵检测； orf5670基因缺失载体的构建：PCR分别扩增orf5670两侧长度约为2000 bp的2条同源DNA片段，并克隆至双功能科斯载体pYH7的合适位点，并在此基础上插入编码Cas9蛋白的基因和特异靶向orf5670基因内部的gRNA序列，构建得到orf5670基因缺失载体； S. thiolactonus NRRL15439 orf5670突变菌株的获得：利用跨属接合转移技术将orf5670基因缺失载体导入S. thiolactonus NRRL15439中，通过抗性筛选及PCR验证得到表型和基因型正确的orf5670突变菌株； S. thiolactonus NRRL15439 orf5670发酵产物检测：尝试不同的培养条件发酵培养S. thiolactonus NRRL15439 orf5670与野生型菌株S. thiolactonus NRRL15439，提取发酵产物进行检测。四、 论文工作进度安排2014/11/012014/11/31 查阅相关文献，了解课题背景及意义，熟悉课题相关实验设计原理及方法；2014/12/012015/02/28 完成相关实验操作的培训，构建基因敲除载体；2015/03/012015/03/31 通过跨属接合转移将基因敲除载体导入至S. thiolactonus NRRL15439菌株内；2015/04/012015/04/30 筛选得到orf5670基因缺失突变菌株并验证正确；2015/05/012015/05/31 完成orf5670基因缺失突变菌株的发酵检测及毕业论文撰写。五、 论文主要文献1 Lestera, Dolak, Thomasm, Castles, E. Truesdell, Oldrichk, Sebekt. Isolation and structure of antibiotic U-68204, a new thiolactone. Infectious Diseases Research, the journal of antibiotics, 1985:2631.2 Jun-Hee Noh, Seon-Hye Kim, Han-Na Lee, Sang Yup Lee, Eung-Soo Kim. Isolation and genetic manipulation of the antibiotic down-regulatory gene, wblA ortholog for doxorubicin-producing Streptomyces strain improvement. Appl Microbiol Biotechnol. 2010, 86:11451153.3 Gang Liu, K F Chater, Govind Chandra, Guoqing Niu, Huarong Tan. Molecular Regulation of Antibiotic Biosynthesis in Streptomyces. Microbiol Mol Biol Rev. 2013, 77(1):112143.4 M J Buttner, K F Chater , M J Bibb. Cloning, disruption, and transcriptional analysis of three RNA polymerase sigma factor genes of Streptomyces coelicolor A3(2). J