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食品中苏丹红I的免疫学快速检测方法研究 fuyunjie1985 前言 苏丹红I 1 苯基偶氮 2 萘酚 属于苏丹红染料的一种 作为化学合成染料 主要应用于鞋油 化妆品等工业产品及其他着色剂等领域 苏丹红I在体内代谢 可被还原为初级代谢产物苯胺和1 氨基 2 萘酚 这些物质会攻击肝细胞 引起中毒性肝病 也可造成神经系统损害 是一种遗传毒性致癌物 苏丹红I 前言 苏丹红I检测现状 目前食品中苏丹红I的检测主要辅助仪器 HPLC IAS HPLC 进行检测 而仪器检测方法普遍存在的缺陷在于 1 检测仪器昂贵2 检测成本高3 操作复杂4 耗时长5 需专业人员操作6 不适宜现场抽查及推广应用 免疫学检测技术解决食品中苏丹红I快速检测的问题 一 研究内容 苏丹红I多抗制备及鉴定 研究内容 苏丹红I免疫学检测方法建立 1 苏丹红I多克隆抗体的制备 苏丹红I多克隆抗体的纯化及含量测定 苏丹红I多克隆抗体的制备 苏丹红I衍生物 明胶免疫抗原的合成 苏丹红I多抗制备 免疫原的制备 利用重氮法合成带有羧基的苏丹红I衍生物 利用混合酸酐法合成苏丹红I 明胶复合物 1 1苏丹红I免疫原的制备 首次免疫 0 5mL完全弗氏佐剂 0 5mL2mg mL免疫原 于兔背部注射 2周后 0 5mL不完全弗氏佐剂 0 5mL2mg mL免疫原 足掌注射 每隔10天 于兔耳缘静脉注射免疫抗原1 0mL 加强免疫3次 最后一次免疫后的7 10天试血 2 3苏丹红I多抗的制备 选择体重2kg的雄性新西兰兔 按照常规免疫程序 制备多克隆抗体 整个免疫过程为2 3个月 2 4多克隆抗体的纯化 2 1苏丹红I衍生物的合成结果 苏丹红I衍生物红外图谱鉴定 a 苏丹红I b 衍生物 b曲线在1700cm 1处存在较强的吸收峰表明反应产物的结构上基本连接羰基 2 2苏丹红I衍生物的色谱分析结果 2 3苏丹红I免疫原的合成结果 2 4SDS PAGE测定IgG的纯度 M 低分子量Maker 1 苏丹红I抗血清 2 AC纯化抗体 3 CA AS纯化 苏丹红I抗血清 有多条带 含有较多杂蛋白 2 经CA AS纯化后 有3 4条较明显的条带 血清经纯化后 大部分杂蛋白被除去 3 经AC纯化后 有两条明显条带 一条为重链 分子量约55KD 另一条为轻链 分子量约14KD 与IgG抗体的重链和轻链的分子量较符合 纯化后的抗体纯度较高 2 5特异性IgG的浓度测定 根据BCA法的标准曲线y 0 5198x 0 2464 R2 0 9778 计算得到 辛酸硫酸铵纯化的抗体浓度为4 24mg mL 亲和层析柱纯化的抗体浓度为1 93mg mL BCA法测定蛋白质浓度 一 研究内容 苏丹红I多抗制备及鉴定 研究内容 苏丹红I免疫学检测方法建立 间接竞争ELISA方法 胶体金免疫层析试纸条法 2 1间接竞争ELISA方法的建立 1 苏丹红I抗体效价的测定 研究内容 3 建立间接竞争ELISA检测方法 2 苏丹红I抗体亲和力的测定 4 待测样品的前处理 2 1 1苏丹红I抗体效价的测定 抗苏丹红I特异性抗体效价测定效价为1 32000 2 1 2苏丹红I抗体亲和力的测定 本实验利用竞争ELISA法 测定抗体的亲和力 若抗体具备较强的亲和力强 则较少量半抗原即可产生50 的抑制率 故常用IC50 即产生50 抑制率时半抗原的浓度 来表示抗血清的亲和性 以10 抑制率时的苏丹红I浓度作为最低检测限 抑制率 100 OD1 OD阴性 OD2 OD阴性 100 其中 OD1为竞争孔的OD值 OD2为不含苏丹红I孔的OD值 抗血清亲和性IC50 15 0ng mL 最低检测限IC10 1 0ng mL 2 1 3间接竞争ELISA的建立 酶标记的苏丹红I抗原与待测样品中可能存在的苏丹红I竞争性的与固相载体上的苏丹红I抗体结合 显色程度与样品中苏丹红I含量成反比 根据待测样品的OD值 推算出样品中的苏丹红I的浓度 2 1 4待测样品的处理 称取2 0g的空白辣椒粉样品 准确加入10mL乙腈 均质2min 超声15min 滤纸过滤后过无水硫酸钠柱去水 所得溶液用真空旋转蒸发仪40 旋转蒸干 甲醇 0 02mol LPBS0 2mL溶解残渣 实验结果测得辣椒粉中苏丹红I的加标回收率为85 88 97 83 2 1 5交叉反应率测定 用建立的间接竞争ELISA法测定苏丹红其他染料 计算苏丹红I抗体的交叉反应率 结果表明该方法与苏丹红II 苏丹红III和苏丹红IV的交叉反应率分别为2 7 6 5 和4 1 仅有较低的交叉反应性 说明该方法的特异性良好 二 免疫学检测方法的建立 检测方法的建立 苏丹红I的胶体金免疫层析方法 2 1金免疫层析技术概述 胶体金免疫层析技术是近年来发展起来的一项新型体外快速诊断技术 该技术发展迅速 已在食品安全 医学检测 农药畜牧 生物反恐等多应用领域中得到了广泛发展 本研究应用竞争抑制免疫层析的原理 样品中的苏丹红I在流动的过程中与金标苏丹红I抗原 竞争结合NC膜检测线上苏丹红I多克隆抗体 通过检测线T是否显色判断结果 2 2金免疫层析试纸工作原理 强阴性阴性怀疑阳性 2 2胶体金免疫层析试纸法的建立 1 胶体金溶液的制备 研究内容 3 免疫层析试纸的制备 2 金标抗原的制备 4 试纸条的检测 2 2 3胶体金溶液的制备 胶体金的制备多采用还原法 本研究利用柠檬酸三钠还原法制备24 5nm的胶体金 2 3 4金标记抗原的制备 1 用0 2mol L的K2CO3调节金溶胶至pH9 0 2 将苏丹红I抗原与胶体金结合 搅拌15min 3 加入PEG20000 静止2h 低速离心25min 4 取上清 高速离心50min 弃上清 5 用稀释液将沉淀恢复至原体积 高速离心50min 6 将沉淀 金标抗体 恢复至原体积的1 10 1 硝酸纤维素膜的选择 条件优化 3 金标抗原喷涂量的选择 2 NC膜上抗体浓度的选择 2 3 4免疫金试纸条的制备 2 3 5胶体金免疫层析试纸的测试 配制标准浓度的待测液 使得苏丹红I的浓度分别为0 5 10 15 20 g kg 取90uL滴加在试纸的样品区 10min后观察结果 结果判断 若C T亮度基本一致 表示阴性结果 若C线亮度明显亮于T线 表示阳性结果 若均未出现C T两线 表示该试纸无效 2 3 6试纸条测试结果 苏丹红I浓度达10ug kg时 检测线T的颜色明显变淡 即试纸条的检测限为10 g kg 各重复数值的变异系数 9 23 05101520 浓度 g kg 2 3 7实际样品测定 从市面上随机购买两种辣椒粉样品 分别进行试纸条和HPLC实验测定 验证试纸方法的准确性 A为苏丹红I标准品 检测波长为476nm B1 B2为辣椒粉样品的试纸条检测结果 B1为阴性 B2为阳性 C1 C2为HPLC的检测结果 B1 6 663 g kg B2 12 165 g kg 两种检测方法的结果一致 免疫层析试纸条测试结果具有一定可靠性 2 3 8ELISA ICstrip HPLC三种方法的比较 为了验证两种方法的准确性 将检测结果同HPLC法进行比较 结果表明 这3种方法测定的结果具有高度相关性 测定结果为3次测试的平均值 变异系数 10 7 表1三种检测方法的比较