RT-PCR检测卵巢肿瘤中EGFR和CK-20的表达及意义.doc

RT-PCR检测卵巢肿瘤中EGFR和CK-20的表达及意义作者：邹忠香，徐杰，沙秀敏，张素华单位：山东，烟台市莱阳中心医院妇产科【摘要】 目的 研究表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因和细胞角质蛋白20(cytokeratin-20，CK20)在卵巢上皮性肿瘤中的表达及意义。方法 应用RT-PCR法检测12例正常卵巢(对照组)、18例卵巢良性肿瘤(良性组)、33例卵巢上皮癌(恶性组)组织中EGFR、CK20 mRNA的表达，分析二者与卵巢肿瘤发生发展及转移的关系。结果 (1)原发性卵巢上皮癌组织中EGFR和CK20 mRNA的阳性表达率显著高于正常卵巢及卵巢良性肿瘤组织(P<0.05);(2)EGFR mRNA表达与原发性卵巢上皮癌手术病理分期有关，其在期卵巢癌患者组织中的表达阳性率高于期患者组织(P<0.05);CK20 mRNA表达与卵巢上皮癌手术病理分期、淋巴结转移有关(P<0.05)，其在期和有淋巴结转移组的患者组织中阳性表达率分别高于期和无淋巴结转移组患者(P<0.05);(3)EGFR与CK20基因表达之间有显著相关性(P<0.05)。结论 (1)EGFR mRNA和CK20 mRNA在卵巢癌组织中有较高的表达，可能与卵巢癌发生、发展和转移有关;(2)检测卵巢癌组织中EGFR mRNA、CK20 mRNA的阳性表达对判断卵巢癌患者的转移和估计预后有一定的参考价值。 【关键词】 卵巢肿瘤;表皮生长因子受体;细胞角质蛋白20;逆转录聚合酶链式反应Expression and significance of EGFR and CK-20 in ovarian carcinoma ZOU Zhong-xiang,XU Jie,SHA Xiu-min，et al.Department of Obstetrics and Gynecology,Shangdong Province Yantai City Laiyang Central Hospital,Yantai 265200,ChinaAbstract Objective To investigate the expression and significance of epidermal growth factor receptor (EGFR) and cytokeratin-20 (CK20) in ovarian epithelial tumor,and to explore their roles in the tumorigenesis,development and metastasis of ovarian tumor.Methods The expression of EGFR and CK20 were detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) in 12 cases of normal ovary tissue,18 cases of benign ovarian tumor and 33 cases of primary ovarian carcinoma.The relationship between the two genes and the different clinicopathological features were analyzed.Results (1)The positive rates of EGFR mRNA and CK20 mRNA were significantly higher in malignant ovarian specimens than in the normal and benign ones (P<0.05).(2) The expression of EGFR mRNA was correlated to clinical stage in primary ovarian carcinoma,EGFR mRNA in the patients with stage had higher positive expression rate than that in stage(P<0.05).The expression of CK20 mRNA in ovarian carcinoma was related with the clinical stage and lymph metastasis (P<0.05).CK20 mRNA expression rates in patients with stage and in the group with lymph node metastasis were significantly higher than those in stage and in the group without lymph node metastasis respectively(P<0.05).(3) There was distinct correlation between EGFR mRNA and CK20 mRNA expression (P<0.05).Conclusion (1) The expressions of EGFR mRNA and CK20 mRNA are higher in ovarian cancer and may be correlated to the occurrence,development and metastasis of ovarian carcinoma.(2) Detection of EGFR mRNA and CK20 mRNA can offer a valuable reference to evaluate the metastasis and prognosis in ovarian carcinoma.Keywords ovarian carcinoma;epidermal growth factor receptor;cytokeratin-20;reverse transcription polymerase chain reaction原发性卵巢癌是世界范围内妇女常见的恶性肿瘤，复发和转移是主要致死因素。近20年来卵巢癌的发病率有上升的趋势，其病死率已居各类妇科肿瘤的首位1。卵巢癌具有临床发现晚、转移早、治疗效果不好等特点，多数患者就诊时已处于疾病的晚期阶段。研究和寻找有关卵巢癌诊断、转移及复发的生物学标记物对于指导治疗、提高术后生存率有十分重要的意义。本研究应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测表皮生长因子受体(EGFR)与细胞角蛋白20(CK20)在不同卵巢肿瘤中的表达，探讨作为卵巢癌肿瘤细胞标志的可能性,并分析两者的相关性意义。1 对象与方法1.1 研究对象 选择我院2005年1月至2008年12月卵巢上皮性肿瘤手术切除标本51例，经病理组织学证实。其中卵巢良性肿瘤18例(浆液性肿瘤10例，黏液性肿瘤8例)，原发性卵巢上皮癌33例(卵巢浆液性癌24例，卵巢黏液性癌9例)。另取同期12例子宫肌瘤患者手术切除的部分卵巢正常组织作为对照。患者年龄2175岁，中位年龄50.5岁。卵巢恶性肿瘤临床分期按照FIGO分期标准，其中期7例，期5例，期14例，期7例，患者术前均未进行化疗和放射治疗。1.2 方法1.2.1 标本采集及处理 所有标本手术后30 min1 h迅速取组织冻存于-70 冰箱备用。1.2.2 主要试剂及引物 总RNA提取液、RT-PCR试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司。从Genbank中查到CK20、EGFR及内参照基因GAPDH的基因序列，采用PCGENE软件设计出引物如下：CK20 mRNA上游引物：5′-CAGACACACGGTGAACTATGG-3′，下游引物：5′-GATCAGCTTCCACTGTTAGACG-3′，扩增片段370 bp;EGFR mRNA上游引物5′-AACACAGTGGAGCGAATTCCTTT-3′，下游引物5′-GGAAGTCCATCGACATGTTGCT-3′，扩增片断262 bp;GAPDH mRNA 上游引物5′-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3′，下游引物5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′，扩增片断146 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。1.2.3 总RNA提取 按RNA抽提操作手册(大连宝生物工程公司)的方法提取组织总RNA。提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，通过紫外分光光度计测定260 nm与280 nm吸光度值而计算RNA的纯度与浓度。1.2.4 逆转录反应，cDNA的合成 按试剂说明操作。反应体系：dNTP Mixture 1 μl,Template RNA 1 μg,RNase Freed H2O至10 μl，65 孵育5 min后置于冰上，加入5×Prime Script Buffer 4 μl，RNase Inhibitor 0.5 μl，Prime Script RTase 0.5 μl，RNase Freed H2O 5 μl,30 10 min，42 20 min，95 5 min后置于冰上。逆转录出的cDNA用于PCR反应或于-20 保存备用。1.2.5 聚合酶链式反应 取上述逆转录反应液2 μl，加入10×PCR Buffer 2 μl,dNTP Mixture 0.8 μl,TaKaRaExTaqHS 0.2 μl，上下游引物各1 μl，RNase Freed H2O 13 μl。CK20反应条件：94 预变性5 min，94 变性30 s，63 退火1 min，72 延伸30 s，循环35次。EGFR和GAPDH反应条件：94 预变性5 min，94 变性1 min，60 退火30 s，72 延伸1 min，35个循环，72 延伸7 min。反应产物取10 μl行2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶染色，紫外光下照相记录。1.3 统计学分析 两组阳性率差别的假设检验和EGFR、CK20表达的相关性采用χ2检验;显著水平为双侧α=0.05。以上统计学处理均采用SPSS 14.0软件包进行。2 结果 2.1 mRNA正常卵巢及卵巢肿瘤组织中EGFR、CK20及内参照GAPDH mRNA的电泳结果 在RT-PCR方法检测EGFR和CK20 mRNA表达水平过程中，所有的组织标本均是在相同的实验条件和步骤下进行的。为保证实验的可靠性，所有标本均至少重复一次PCR反应。EGFR、CK20 mRNA及内参照基因GAPDH mRNA的PCR扩增片断分别为262 bp、370 bp和146 bp。所有的正常卵巢及卵巢肿瘤组织中均有内参照基因GAPDH的表达(图1，2)。2.2 正常卵巢、良性卵巢肿瘤、原发性卵巢上皮癌组织中EGFR与CK20 mRNA的表达 EGFR mRNA在正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤、原发性卵巢上皮癌中的阳性表达率分别为16.7%、22.2%和72.7%。原发性卵巢上皮癌组织中EGFR的阳性表达率显著高于正常卵巢及卵巢良性肿瘤，差异有统计学意义(P<0.05);卵巢良性肿瘤组与正常卵巢组比较阳表1 卵巢肿瘤中EGFR和CK20 mRNA的表达结果注：同原发性卵巢上皮癌比较，*P<0.05;同浆液性癌比较，P>0.05M：DNA Marker;15：正常卵巢、卵巢良性肿瘤和恶性肿瘤中GAPDH mRNA的表达;67：EGFR mRNA在卵巢癌中的表达;89：EGFR mRNA 在卵巢良性肿瘤中的表达;10：正常卵巢组织中EGFR mRNA 的表达;11：阴性对照(262 bp处为EGFR mRNA，146 bp处为GAPDH mRNA)图1 EGFR mRNA在组织中表达的电泳结果M：DNA Marker;13：原发性卵巢癌组织中CK20及GAPDH mRNA的表达;45：卵巢良性肿瘤组织中CK20及GAPDH mRNA的表达;6：正常卵巢组织中CK20及GAPDH mRNA的表达;7：阴性对照(370 bp处为CK20 mRNA，146 bp处为GAPDH mRNA)图2 CK20 mRNA在组织中表达的电泳结果性表达率差异无统计学意义(P>0.05)。浆液性卵巢肿瘤与黏液性卵巢肿瘤组织中，EGFR mRNA的阳性表达差异无显著性意义(P>0.05)，见表1。CK20 mRNA在正常卵巢组织中无表达，在卵巢良性肿瘤、原发性卵巢上皮癌中的阳性表达率分别为16.7%和48.5%。CK20在原发性卵巢上皮癌组织中的阳性表达率显著高于正常卵巢及卵巢良性肿瘤，差异有统计学意义(P<0.05)。在卵巢黏液性上皮癌和浆液性上皮癌组织中，CK20 mRNA的阳性表达差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。2.3 EGFR及CK20 mRNA表达与原发性卵巢上皮癌患者临床病理特征的关系 卵巢上皮癌组织中EGFR mRNA的表达与患者年龄、组织学分型、细胞学分级及淋巴结转移无关，差异无统计学意义(P>0.05)，但其表达与FIGO分期有关。EGFR阳性表达率在期患者组织中为50.0%，期患者中为85.7%，期组织中EGFR阳性表达率高于期，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。统计分析显示，卵巢癌组织中CK20 mRNA的表达与卵巢癌患者的年龄、组织学类型及细胞学分级无关(P>0.05)，而与卵巢癌的手术病理分期及淋巴结转移有关。CK20在和有淋巴结转移的卵巢癌患者组织中阳性表达率分别为61.9%和80.0%，明显高于和无淋巴结转移患者(分别为25.0%和34.8%)，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。2.4 卵巢上皮癌组织中EGFR、CK20表达之间的关系 在33例原发性卵巢恶性肿瘤组织中,CK20与EGFR共阳性表达16例，共阴性表达8例。χ2检验分析发现CK20与EGFR之间有显著相关性(P=0.014)，见表3。3 讨论3.1 EGFR的生物学特性及在卵巢肿瘤组织中的表达 EGFR是由C-erbB-1基因编码的一种糖蛋白的跨膜受体，它的激活可引发更多的癌蛋白激活，在肿瘤的发生发展中起重要作用。人EGFR基因位于第7号染色体p13q22区，全长200 kb，由28个外显子组成，编码1 186个氨基酸，其糖蛋白分子量约表2 EGFR和CK20 mRNA表达与卵巢上皮癌患者临床病理特征表3 EGFR与CK20 mRNA表达的相关性170 kDa，与HER2/ErbB-2/Neu、HER3/ErbB-3、HER4/ErbB-4等归入HER/ErbB家族，同属于受体酪氨酸激酶(RTKs)。其配体包括EGF、TGF-α、amphi-regulin、hepatinbinding EGF等。EGFR在正常上皮、间质、神经源性组织中都有表达，在调节正常细胞的生长和分化中起重要作用。EGFR过度表达,则持续向细胞内传递分裂增殖信号,干扰细胞分化的正常调控状态，引起细胞持续增殖,发生恶性转化。而肿瘤也可以自分泌或旁分泌的形式产生EGF、TGF-α(transforming growth factor)等特异配体，促进肿瘤细胞的增殖、黏附、转移以及血管生成，抑制肿瘤细胞的凋亡，进而促进EGFR高表达肿瘤的进展2。临床研究显示，肺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、脑胶质瘤以及头颈部恶性肿瘤等肿瘤都有一定程度EGFR高表达，而且在分化低、有转移的病例EGFR的阳性率明显增高3，4。有学者研究表明70%100%的卵巢癌组织中有EGFR高水平表达5。Fresno等6研究表明,EGFR在卵巢癌中高表达,恶性卵巢肿瘤比良性肿瘤EGFR表达高。Tomov 等7采用免疫组化方法研究了EGFR在良、恶性卵巢肿瘤中的表达情况，结果发现恶性卵巢组织EGFR的表达率显著高于良性组织，差异有显著性意义;有腹水和进展期的病人其EGFR表达率更高。EGFR高表达肿瘤患者预后差，易发生转移，复发时间短，复发率高，存活期短8。Alper 等9研究表明卵巢癌细胞中EGFR的过度表达,导致侵袭力增加。EGFR与卵巢肿瘤病理类型是否有关国内外均有不同的报道10，11。本研究中发现33例卵巢癌组织中，EGFR mRNA阳性表达者24例，表达率为72.7%，而其在卵巢良性肿瘤和正常卵巢组织中阳性表达率分别为22.2%和16.7%。EGFR在卵巢恶性肿瘤组织中的表达率明显高于良性和正常卵巢组织(P<0.05)。卵巢上皮癌患者中，EGFR的表达与肿瘤的组织学类型、细胞学分级及淋巴结转移无关(P>0.05)，而与患者手术病理分期有关，即随着临床期别的增加，EGFR mRNA的阳性表达率增高，其在期的卵巢癌患者组织中的阳性表达率(85.7%)明显高于期卵巢癌组织(50.0%)(P<0.05)，说明EGFR参与了卵巢肿瘤的发展过程，EGFR高表达的肿瘤细胞具有更强的转移力和侵袭性。3.2 CK20的生物学特性及在卵巢肿瘤组织中的表达 细胞角蛋白(cytokeratins,CKs)是分布于上皮细胞的中间纤维,它含有二十多种异构体，分为酸性细胞角蛋白(型细胞角蛋白，细胞角蛋白1020)和碱性细胞角蛋白(型细胞角蛋白，细胞角蛋白19)两个亚家族。CK20是细胞角蛋白家族中发现最晚的一个亚型，不同于其他细胞角蛋白，是一类水溶性聚合多肽。它非常局限在胃肠道上皮细胞,正常淋巴组织、血液组织、骨髓组织不表达,大肠癌中高表达;且在肿瘤侵袭、转移、扩散到其他组织器官时,始终保持稳定，从而使CK20成为一种新的肿瘤诊断标志物。有研究发现12，对肿瘤组织的切片染色中，以下肿瘤表现为CK20阳性：原发及转移的结肠癌、胃腺癌、卵巢黏液腺癌、泌尿道移行上皮癌、胆囊和胆管腺癌、胰管细胞腺癌。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术较常规细胞涂片的HE染色的灵敏度提高1 000倍,较免疫组化至少提高灵敏度100倍。在本研究中，我们检测到CK20在正常卵巢组织中无表达，在卵巢黏液性癌中的表达率为77.8%，在浆液性癌中的表达率较低，为37.5%，但在两种类型的肿瘤组织中表达差异无统计学意义，提示CK20表达阳性并不能完全排除卵巢浆液性肿瘤的可能。我们的研究同时还表明CK20 mRNA的表达与卵巢恶性肿瘤的分期、淋巴结转移相关，随着临床分期的增加，CK20 mRNA的阳性表达率增加，这一结论与Rotern等13报道一致，但差异无显著性意义。据文献报道14,在癌变细胞的恶性增生中，角蛋白存在一系列改组重建过程以适应其形态功能的变化，癌变细胞中间纤维丝合成活跃，肿瘤细胞运动性强，侵袭力及转移力强，易发生转移。依本组病例检测结果看，CK20 mRNA的表达与卵巢癌的发生、发展可能有一定相关，然而因本组病例例数较少，尽管统计学分析有显著性意义,但CK20能否看作一个很有用的生物学指标还有待进一步研究。3.3 EGFR与CK20在卵巢恶性肿瘤组织中表达的相关性 EGFR是G蛋白、细胞因子受体、整合素等多种信号作用的交汇点，EGFR的活化可激活多条信号传导通路，这些信号传导通路之间相互联系、相互影响，可影响多种相关基因的表达。本研究发现，EGFR与CK20在卵巢恶性肿瘤组织中均有较恒定的表达，且二者的表达均与卵巢上皮癌患者手术病理分期有关。同时，在33例卵巢恶性肿瘤组织中,CK20与EGFR共阳性表达16例，共阴性表达8例。χ2检验分析发现CK20与EGFR之间有显著相关性(P=0.014)，因此认为二者的阳性表达可能与卵巢癌的发生、发展和转移有一定关系。总之,EGFR、CK20的阳性表达与卵巢癌的发生、发展和转移都有一定相关性,进一步证实二者在卵巢肿瘤中的作用，对于阐明卵巢癌发病机制，判断卵巢癌患者的转移和估计预后均有一定的参考价值。【参考文献】 1 连利娟.林巧稚妇科肿瘤学，第4版.北京：人民卫生出版社，2006，551.2 Sibilia M，Fleischmann A，Behrens A，et al.The EGF receptor provides an essential survival signal for SOS-dependent skin tumor development.Cell，2000，102(2)：211-220.3 Slichenmyer WJ，Fry DW.Anticancer therapy targeting the erbB family of receptor tyrosine kinases.Semin Oncol，2001，28 (5 Suppl 16)：67-79.4 Herbst RS，Langer CJ.Epidermal growthfactor receptors as a 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