默克密理博的Amicon离心超滤.doc

默克密理博的Amicon离心超滤装置是一种理想的工具，可以用来对盐分、糖类、核酸、非水溶剂及其他一些低分子量物质进行去除和更换。他们还可以用来分离未结合上的游离标记物。密理博离心超滤装置具有快速、方便、回收率高的特点，可替代并优于透析及乙醇沉淀。Amicon Ultra-4和Amicon Ultra-15具有高速度高回收的特点。他们使用低吸附性的Ultracel再生纤维素超滤膜，可用于蛋白质、抗原、抗体、酶和微生物的浓缩纯化。其快速和高回收的特点非常适合于脱盐和缓冲液置换。Amicon Ultra离心超滤装置经常用于对蛋白质色谱纯化过程产生的色谱柱组分进行浓缩和脱盐。以下两个例子展示了Amicon Ultra离心超滤装置对于蛋白质和活性酶回收的应用。方法1. 选择具有合适NMWL和体积的离心超滤装置；2. 把样品置于过滤装置的储液管中；3. 如果样品体积小于过滤装置的最大体积，则可以把它稀释到最大体积后再离心，这有助于更有效地除去盐分；4. 在特定的离心力下和推荐的时间进行离心；5. 将滤过液从滤管中取出，放置一旁；6. 加入水或缓冲液使样品体积达到4ml(Amicon Ultra-4)或15ml(Amicon Ultra-15);7. 再次离心；8. 取出滤过液，放置一旁；9. 回收浓缩的已脱盐样品。注意：请将两次的滤过液一直保留到浓缩的样品分析测试完成。结果：盐分通过滤膜的过程不依赖样品的浓度和体积，用超滤的方法来脱盐并不改变缓冲液的组成，比如说，含有500mM盐分的溶液在初次离心后它的盐浓度并不发生改变。再往超滤管中剩余溶液中加入水或无盐缓冲液，再次离心，则会降低溶液中的盐浓度。这个过程我们将它称为等体积超滤，反复多次地操作，可以使溶液盐分降到最低。如果我们想将样品用不同打分缓冲液溶解，则我们可以使用等体积超滤达到目的。样品浓缩后，然后加入目的缓冲液，再进行反复得稀释和浓缩。如表3.1-3.4中所示，使用默克密理博的离心超滤装置，只需一次过滤，样品中90%以上的盐分都被去除。最后，只要再离心一次，可以使样品中高达99%的盐分都被去除，而且样品的回收率高达90%以上。用色谱法进行蛋白质纯化，经常得到许多的色谱组分，而其中只有一些组分中含有目标蛋白质。将这些组分合并后，我们就可能需要通过一步蛋白质浓缩过程将蛋白质储存起来，或者需要通过缓冲液置换将样品浓缩，以便下游的分离。经过细胞破碎、分段富集、去除部分杂质等一系列操作，样本的体积不断加大，蛋白质浓度下降，有时已经不适合后继的蛋白质样本检测或者上样了。怎么办？这个时候不外3类选择：浓缩，沉淀，过柱。过柱既然是分离富集的常用方法，自然也有浓缩特定目标蛋白的效果，生物通前文已有介绍。效果最好的自然是专一吸附富集和洗脱的亲和柱，比如HisTag之类的。如果过柱后洗脱浓度还不够，也要继续用其他方法浓缩。亲和沉淀或者免疫沉淀原理也一样-比如琼脂糖偶联抗体做亲和沉淀-借助抗体吸附目标蛋白，借助琼脂糖重力离心沉淀，能有效的富集纯化目标蛋白，缩小体积，而且不影响目标蛋白活性。但是多数情况下，无处可觅亲和的“那一半”，又要继续后继实验，就只好采用浓缩或者沉淀。浓缩由于沉淀可能导致或多或少的样本损失，不可逆沉淀等问题，原则上，能不用都尽量不用沉淀的方法。冷冻干燥相对能比较好的保持蛋白质活性，非常有效的缩小溶液体积和提高浓度，而且没有什么损耗和花费。问题是你首先得有冻干机，而且冻干不能去除样品溶液中的盐等其他杂质。超滤是浓缩样品的更好的选择。超滤是一种膜分离技术，它的特点是使用不对称多孔膜，根据分子的大小来分离溶液中的大分子物质与小分子物质，是一种温和的、非变性的物理分离方法，尤其适用于蛋白质等大分子溶液的浓缩，纯化以及缓冲体系交换等。超滤操作最简单的工具莫过于离心超滤管-通过离心力，使溶液中的小分子溶液和溶剂透过超滤膜,被收集在滤过液收集瓶中，而大分子溶质则被超滤膜截流在样品浓缩管中。该方法的特点是操作简便，只需要高速离心机，无需其他特殊设备，速度快，可以相当地有效浓缩样本，而且可以部分去除样本溶液中的盐、去垢剂等可溶性小分子，有利于更换缓冲体系。操作：离心超滤管的使用非常简单，按照样品量和目标分子量选择适当的离心超滤管，加入待浓缩的样品溶液，按照超滤离心管指示离心速度和时间离心，最后回收滤管中截留的样品溶液。回收率：一般回收浓度大于0.1mg/ml的溶质，回收率可达90%以上。通常样品损失是由于滤膜表面和容器表面的非特异性吸附引起的。选择口碑好、高品质的离心超滤管非常重要，因为高品质的离心超滤管选用低吸附材质，精细抛光，可最大限度地降低了吸附性。滤膜表面样品的吸附量与样品和滤膜材质有关，一般为2-10g/cm2。如果研究的对象是滤过液，由于其滤过时要穿过滤膜的整个内部结构，所以吸附量相对较大，为20-100g/cm2。通常截留分子量高的膜吸附较高，而截留分子量低的膜吸附较低。eBioTips1：为了得到最高的收率，所选滤膜的截留分子量MWCO建议选择所需截留分子大小的1/3左右，不超过目标分子量的一半。因为超滤膜上孔径是平均孔径，膜上的孔并非均匀，离心高压下也可能渗漏，因此截留孔径越小，流速越慢但截留比例更大。eBioTips2：如果样本浓度低体积大，可选择较小容积的离心超滤管多次重复加样离心。如果同时需要脱盐和去除可溶小分子杂质，可将待浓缩样品稀释到离心超滤管最大容积再离心，重复2次可除去99%盐。eBioTips3：避免过长时间或者过速离心，虽然高品质的产品都有防死端设计，可避免过度离心造成膜表面干而造成不可逆吸附。避免过度浓缩，最终体积越小，越容易因表面吸附而损失得率。离心后用Tips轻轻吹吸几次滤膜截留的溶液，必要时补加一定体积的缓冲液冲洗膜表面，有助于减少膜表面吸附，能提高回收率。尽量避免Tips接触膜表面。eBioTips4：有些置于2ml离心管的那种Mini离心超滤管可以反向套入离心管中离心（管子上下一样宽的那种一般都可以），以方便用离心法回收截留蛋白质样品，可使浓缩液达到近乎完全回收，不用Tips，对于样品体积小的就很好。赛多利斯的Vivaspin 2ml带有一个回收帽，也可以反向离心后可加盖保存回收样品，但是那个管子很长，要配15ml离心管的离心机，不过有几种膜可以选择。eBioTips5：离心超滤管通常也不能消毒（个别种类特别说明除外，如再生纤维素(RC)膜的离心超滤管可以121度消毒，但是注意那个pH范围比较小，别因为消毒就选错），一次性使用。由于单管价格并不便宜（20-90元），不少人尝试重复使用-经验是用蒸馏水清洗膜表面多次，离心一次到两次，那种可以反向离心的小管子可以加蒸馏水浸泡后反向多离心一次，会好些。可重复用于同一样品，不用时可用蒸馏水浸泡，但是要防止细菌污染。不同样品就不要混用了。有人说用20%酒精，还有人说用1N的NaOH洗涤，但也有人说会破坏膜结构。反正厂家一般不支持重复用。多次重复使用会堵塞滤膜上的孔径，甚至出现漏液现象，影响实验结果。eBioTips5：离心超滤管通常不需要预处理即可使用（个人经验，用蒸馏水洗一次会好些），不过对于蛋白质样本处理，特别是较稀的蛋白质溶液来说(10ug/mL),用超滤膜浓缩回收率常常是不定量的。虽然PES材料使非特异吸附最小化，但是,某些蛋白,特别是稀的时候,会有问题。非特异结合的程度随着个别蛋白结构的不同而不同。含有带电的或者疏水结构域的蛋白质更易于不可逆结合到不同表面。对超滤离心管表面做钝化预处理可降低蛋白质在膜表面的吸附性损失，大多数情况下，在浓缩稀蛋白溶液之前预处理(钝化)柱子可以提高回收率，因为钝化溶液可填满膜和表面暴露的空白蛋白吸附位点。钝化的方法是预先用最高容积的钝化溶液预浸泡柱子1小时以上，蒸馏水彻底冲洗柱子，再用蒸馏水离心一次以彻底除去可能残留在膜上的钝化溶液。注意钝化处理后别让膜干了。如果要留待以后使用，需要加无菌蒸馏水保持膜湿润。常用的钝化溶液可选择： a. 1牛血清白蛋白磷酸缓冲液溶液 b. 5十二烷基磺酸钠蒸馏水水溶液 c. 5Tween-20非离子活性剂蒸馏水溶液 d. 5Triton-X 蒸馏水溶液 e. 5聚乙二醇化合物蒸馏水溶液 f.1免疫球蛋白IgG磷酸缓冲液溶液eBioTips6：离心超滤管因为需要高速离心，某些对剪切力或压力诱导下易变性的不稳定样品可能不太适合。另外超滤膜上孔径是平均孔径，膜容易堵，对于有微小颗粒或者碎片的样品，最好能先用较大孔径的离心超滤管过滤一次，再进行下一步浓缩。膜材质：选择超滤膜主要根据膜的材质，截留分子量以及综合性能等，但是超滤的效果取决于待超滤的样品溶液的特性，有条件的可以试试不同材质的膜。没有条件就随大流。聚醚砜PES是超滤离心管中最常见的材质，具有较高的化学和热稳定性，耐碱能力强(pH范围1-14)，通量大，流速快。其他材料还有三醋酸纤维素(CTA)、再生纤维素(RC)和Hydrosart(HY)。三醋酸纤维素（Cellulose Triacetate，pH范围3-11）亲水性强，非特异性吸附极低，溶剂和小分子溶质在过滤时不会因被膜吸附而产生损失，适合样品洗涤、除蛋白以及其他需要回收滤液的操作。再生纤维素（Regenerated Cellulose，pH范围4-8）也是一种高度亲水的膜，对蛋白的吸附极低，可以高压灭菌，容易清洗，耐酸碱性能及耐溶剂性能好。当用于从低蛋白浓度的稀释液中回收蛋白时，可以得到极高的收率。Hydrosart超滤膜（pH范围3-11）是Sartorius公司的专利产品，