庆大霉素抗菌株.doc

通过低水平诱导庆大霉素的抗性提高抗生素产量【摘要】 目的：筛选出庆大霉素抗性突变株，并且寻找到对庆大霉素的抗性和抗生素产量之间存在的关系。方法：筛选出庆大霉素低水平抗性突变株，然后检测其抗生素产量。此外，突变株的稳定性是在没有庆大霉素的不完全培养基中通过连续传代培养的方法来提高的。在突变株及其亲本中，Act-ORF4和RedD（RedZ）的蛋白质表达的分析及其比较是使用了Western 印迹法。结果：与传统的菌种诱变方法相比，提高抗生素产量的突变株需要在3%到20%的高频率下检测。此外，Western 墨迹分析显示，庆大霉素抗性突变株可以激活或者增强actionorhodin（Act）和undecylprodigosin（Red）在链霉菌生物合成过程中的表达，因为其间接或直接的分别上调了Act-ORF4和RedD（RedZ）的蛋白质表达，还有Act和Red在生物合成途径中的正向调节。结论：提高链霉素和其他细菌抗生素生产的方法，即通过对庆大霉素的低水平抗性的诱导，这种方法是切实可行的。【关键词】 庆大霉素 突变株 链霉菌 抗生素1. 介绍包括抗生素在内的次级代谢产物主要是丝状菌在进行形态分化时的产物，据我们所知，这些产物中，已知的抗生素大概有17%，放线菌也有74%。芽孢杆菌属的单细胞细菌在这一方面也很活跃。链霉菌属的分子遗传学的最新进展是的我们不仅能够从结构上阐明他们通过基因生物合成次级代谢产物，而且能够从细胞层面上检测整个的细胞分化的过程。举个简单的例子，链霉菌属的Act-ORF4基因和redDorf1基因强调了生产抗生素基因簇本身的调节类型。尽管这样的信息到目前为止还没有在有工业价值的菌种上得到成功应用，但是有复合的生物合成的理性方法已经渐渐地用来生产新的化合物了。我们需要的遗传更加稳定的菌株（代谢产物高产）的获得需要多个有利突变的积累。以前经典的菌种改良的方法往往依赖于紫外线辐射或者化学诱变。但是这样的方法在遗传上往往是不连续的，而且会明显导致细胞出现致命损伤，所以我们可以认为这样的方法是相当的低效。众所周知，核糖体是mRNA中是负责翻译遗传信息编码基因的蛋白质。翻译过程的精度对有机体的生存是至关重要的，但是基因移码在翻译时常常会影响精度。氨基糖苷类抗生素是非常常见的基因移码的产物，生成这些东西是因为核糖体的结合，因为改变了核糖体更高级的结构从而失去了其翻译的保真度。现已证明，诱导产生的基因移位的核糖体结构的变化与这些基因各自的表现型相关。基于这些观察，通过改变核糖体的工程从而调节抗生素的生物合成是可行的方案。Ochi和他的同事们已经获得了一类在rpsL基因（编码核糖体S12的蛋白质）上基因突变的菌株，证明是对链霉菌的抗性是有效地，大大影响了链霉菌和芽孢杆菌中聚酮化合物和其他抗生素的生产。我以前的研究表明，另一种氨基糖苷类抗生素庆大霉素也能导致S.coelicolor的放线菌生产过剩。在这里我们进一步研究出合理的方法，通过对庆大霉素的低水平诱导诱导出突变株来提高某些细菌抗生素的生产能力。2. 材料和方法菌株和突变株的准备链霉菌spp菌株和其他用到的细菌，列在表一里。原始菌株在琼脂平板上各自培养3到7天的新鲜的孢子悬浮液或细胞。将庆大霉素抗性突变株放入平板生长5到8天（对链霉菌属）或者3到6天（对其他细菌），细胞孢子悬浮液分步在GYM琼脂培养基上分布在不同的浓度上，如表二显示。获得的独立的菌株用作后续的研究。表一表二培养基和培养条件GYM、R4、SMMS、SYM和GGA培养基是和之前描述的一样制作出来。对链霉菌属和s.coelicolor的培养条件和以前报道过的条件是一致的。抗生素生产能力的测定是通过使用三组培养平板实现的，其效价是样本的平均值，如表二和表三所示。实验结果再现性是由至少两个的独立实验保证的（如表二、表三、图一、图二、图三）。表三2.3产量和抗生素的测定 2.3.1 actionorhodin和undecylprodigosin 链霉菌属和S.coelicolor 用新鲜的孢子悬浮液接种，在30下培育5天。actionorhodin和undecylprodigosin的产出和之前是一样的。图一 2.3.2链霉菌 灰色链霉菌 13189和它的庆大霉素抗性突变株之前在30下的GYM液体培养基中培养了2天。之后，细胞被收集起来，接种到GP生产培养基中，GP培养基是在GYM培养基的基础上添加了2%（w/v）MgSO47H2O和0.5%（w/v）的蛋白胨，之后会在28下培养3天。链霉素的浓度用枯草芽孢杆菌6633来测定。2.3.3 放射菌素 链霉菌抗生素3720和它的庆大霉素突变株在SYM培养基中生长40h。菌液接种到GGA产物培基上，和之前描述的一样培育5天。产出的放射菌素的浓度是在用醋酸乙酯萃取后在452nm光波处的波长即可测得。2.3.4FR900493 蜡样芽胞杆菌2045和他的庆大霉素突变株在Bouilom 培养基中培养10h。细胞接种到NG培养基中在30下培养48h。FR900493丙酸的浓度是用金黄色葡萄球菌209P测得的。2.3.5 硝吡咯菌素 假单胞菌硝吡咯菌2327在葡萄糖、蛋白胨、麦芽提取培养基上培养。细胞之后会在相同的介质上接种、培养304天。硝吡咯菌素的浓度是用白色念珠菌作为测试生物测定的。图(B/C) 2.4Western印迹分析 GYM液体中的细胞是用描述过的方法超声破壁在合适的时间里收集起来的。培养条件也是和这些菌种生长和抗生素生产的是一样的。Western印迹法是用bht制造的增强化学发光的ECL Western印迹检测系统。针对ORF4、S12、RedD和RedZ的多克隆抗血清是通过向小兔腹腔注射纯化的重组蛋白而制备的。与通过传统方法制得的抗体相比，这些抗体作为第一抗体的比例在1:3000。3. 结果 3.1 激活的S.青霉素菌的抗生素生产 S青霉菌66通常生产两种有颜色的抗体：Act和Red。有趣的是检查S.青霉菌中庆大霉素突变株中Act和Red生物合成的影响。首先，我们试图培养基因青霉菌。在S.青霉菌的孢子悬浮液在含有1 的GYM琼脂培养基中接种培养后，庆大霉素突变株的发生概率在108到10-10上。我们随机挑选了一百个独立的突变株，然后用R4琼脂和液体培养基来检验Act和Red的产量。如表2所示，与野生型菌株相比，统共有12株在Act和Red的生产表现出积极的正向突变。所有的庆大霉素突变株都显示表明对庆大霉素有较低的抗性（2到4倍），如表3所示。很明显，庆大霉素突变株（HU-1、HU-2）中的菌丝体生长和形态分化是受突变株中抗生素的过量生产影响的（表3和图1）。因此我们有必要保藏抗生素高产的稳定遗传的菌株。我们从HU-1中挑选了几株对庆大霉素有高抗性的HU-1菌株，并且按照恢复生长形态和菌丝生长的想法定向设计了HU-3菌株。通过在一系列的无庆大霉素抑制的GYM琼脂培养基中的培养，我们分别从HU-1和HU-2菌株中得到另外两种突变株HU-3和HU-4。如表3和图1显示，不同的庆大霉素突变株会表现出不同的表现型。特别是，在经过4到6代的传代后，他们还能保持着稳定的性状遗传。因为HU-3、HU-4和HU-1、HU-2有着相似的MIC值，所以极有可能HU-4、HU-5中更多的突变是发生在其他的基因位点上。有趣的事情是，在GYM培养基中，HU-3、HU-4、HU-5突变株比起HU-1、HU-2突变株会产生更多的Act和Red，但是在R4培养基中HU-1、HU-2反而能生成更多的。这些观察出来的结果说明了低抗性的庆大霉素突变株能够明显促进S.青链霉素的产出，同时向我们介绍了部分分化形态受损的、稳定不好的突变株并没有减少抗生素的产出。3.2 Act-ORF4、RedD和RedZ蛋白的表达Act-ORF4、RedD（RedZ）已经被证明了对于在S.coelicolor菌株中Act和Red生物合成有着正向的调节。我们分析了在HU-4、HU-5和野生型菌株中这些蛋白质的表达模式。如图2B和图C中所示，与野生型菌株比，HU-4、HU-5中Act-ORF4、RedD和RedZ蛋白的产出都是过量的。Act产量的提高都是伴随着Act-ORF4蛋白的上调。因为比起HU-4，HU-5的菌株在前期生长都是比较缓慢的，所以HU-5中Act-ORF4的积极表达和Act的生产都比HU-4慢得多。这些观察表明，庆大霉素突变株通过直接或间接地分别激活特异性蛋白Act-ORF4、RedD的表达。3.3 relA菌株中抗生素生产的恢复以往的研究表明，一株s.coelicolorA3（2）的relA不仅失去了生产Act和Red的能力，而且因为氮限制的缘故，而且延迟了形态分化。在这里我们在用基因突变得到的A relA突变株中恢复Act和Red的生产。在一种相似的路线上，我们从M600-relA中挑选了100株庆大霉素突变株，并且分析了在SMMS和GYM培养基中Act和Red的生产。HU-6、HU-7突变株在SMMS培养基中生产Act能力相仿，但是与M600、M600-relA在GYM培养基中是过量生产的。这些结果进一步显示庆大霉素突变株M600-relA在氮限制的情况下不仅能够恢复Act的生产，而且气生菌丝体在富氮的情况下也能大量产出Act。3.4 在其他链霉菌中抗生素生产的提高 因为S.lividans和S.coelicolor是相近的两种链霉菌，有必要分析一下其他链霉菌中庆大霉素突变株中抗生素生产的影响。当S.griseus和S.antibioticus的孢子液接种到含有2或者1uh 庆大霉素的GYM培养基中。突变菌株的突变率在10-7和10-8之间，所有的突变株都表现出对庆大霉素的低水平抗性。在我们测量了一百个突变株中抗生素生产后，我们发现15株S.griseus过量生产了链霉素，但是只有5株S.antibioticus过量生产放射菌素（表2）。这些结果表明庆大霉素突变株能够促进其他链霉菌中的抗生素生产，它们促进的效果取决于链霉菌的种类。图3图43.5芽孢杆菌和假单胞菌中抗生素的生产 尽管到目前为止，链霉菌生产大量的抗生素，芽孢杆菌和假单胞菌也生产一些稀有的抗生素或者其他的次级代谢产物。我们用上述类似的方法处理了芽孢杆菌2045和假单胞菌2327的突变株。结果发现大多数（20/100）芽孢杆菌能过量生产FR900493，但是只有少数（3/100）假单胞菌能够这样，这样的结果表明用庆大霉素突变株来调节抗生素生产是根据细菌的种类有关的。 4. 讨论在目前的研究中，我们主要的发现是向大家介绍了对庆大霉素有抵抗性的细菌，并且给了抗生素生产有一个很大的提升。与以前的研究比较，这篇文章可以在一个比较高的频率（3%-20%）比起传统的菌种选育方法，我们可以对饱满的菌株进行传代。重要的是，菌株的稳定性可以通过用其他抗生素的不存在但是保证目的抗生素的过量生产，尽管到目前为止我们还不清楚其中的机制。发展新的理性的提高菌株生产的方法现在已经成了应用生物学科和工业上的热门话题，但是我们发现很少有人将目光转向核糖体的功能分析或者翻译途径。大多数以前的研究都表明核糖体能直接或间接地调节着抗生素生物合成机制。举个例子，链霉菌和芽孢杆菌relA、relC突变株向我们展示了ppGpp合成途径的受损，同时其抗生素的产量和形态分化也受了很大的影响。在某些细菌中，rpsL基因位点（翻译核糖体S12）上的突变株能够促进提高抗生素合成系统的能力。bldA(编码亮氨酸tRNA)从UAA翻译水平上对Act生物合成有着影响。现在已经证明庆大霉素能和核糖体相互影响，并且能和核糖体上多个位点结合，以至于庆大霉素的抗性机制相当复杂。与此一致的是在链霉菌和其他细菌中只有对庆大霉素有低水平抗性的突变株能够提高抗生素的生产，这代表其中存在着的特别的机制。因为S.lividans的庆大霉素抗性突变株能够促进Act和Red两种抗生素生物合成的过程，所以我们有理由相信庆大霉素抗性突变株中抗生素合成的调节在高水平上的调节是多效的。以前的研究表明，庆大霉素作为一类氨基糖苷类抗生素，强烈的诱导在vivo核糖体的构象，且与其表型息息相关。尽管我们还没有找到突变位点，我们还在思索庆大霉素抗性突变株是如何通过诱导核糖体构象改变从而改变核糖体功能来提高抗生素生产的。这些突变株中核糖体有可能是调节抗生素合成蛋白质途径，或抑制了蛋白质的表达。氨基糖苷类抗生素是一类能直接结合到tRNA上的抗生素，减少了翻译的频率，抑制了保持EGFGDP核糖体复合物稳定性的核糖体的翻译。以前的研究表明一些细菌中在rplS基因（编码核糖体L6蛋白质）位点和16Srrn（编码核糖体16S RNA）位点导致了庆大霉素高水平抗性的缓和。尽管我们了解每个16S rrn、rpsL、rplF基因（数据没有表示出来），但是我们还是不能够检测出我们的S.lividans的庆大霉素抗性突变株。在几种生产氨基糖苷类抗生素的链霉菌中的去甲基化酶来修改残留的16S核糖体RNA中G-1405，以此来产生对庆大霉素的高抗性这样的机制已经被了解了。与此一致的，我们的小组已经发现metK基因（编码S-ADENOSYLMETHIONINE 合成酶的主要甲基供体）在S.coelicolor（Hosaka T和Hu 未发表数据）链霉素低水平抗性突变株是过度表达的。有可能庆大霉素抗性突变株是参与了16S RNA或者去甲基蛋白的去甲基生物过程，这就导致了对庆大霉素和链霉素的低水平抗性。met基因的功能分析目前已在进程中了，这有助于我们对低水平抗性的未知机制的揭秘。众所周知，从基因突变株中获得抗生素抗性往往是在抗生素缺乏的情况下用合适的代价获得的，在一些细菌中第二位点突变株得到的突变株的相关机制已经被分析出来了。与此一致的是，我们的观察发现庆大霉素抗性突变株影响了细胞生长和形态分化，从而导致了不稳定表型。为了找到一个可行的菌种筛选方法，有必要找到方法来保证菌种的稳定性。在目前的研究中，我们发现在经过一系列缺乏庆大霉素的培养后，庆大霉素抗性突变株可以用一未知的菌株补偿其活性从而自身活力增强，因而菌株能够表现出抗生素过量生产的稳定表型，但往往需要一种新的氮源环境。因此，这些菌株的培养基优化是非常必要的。尽管我们缺乏庆大霉素突变株机制的分子水平的了解，但这些突变株中Act、Red通过Act-ORF4和RedD（RedZ）生物合成途径调节蛋白质的合成是过量合成的，分别提高了Act和Red的过量生成。这些观察表示了 庆大霉素基因突变株能够通过抗生素的单个的翻译途径促进抗生素的产出。鸣谢我们感谢Yuzuru Tozawa和Susumu Okamoto 为我们提供了使用的抗体。 我们同样感谢 Dr.Kozo Ochi 因为他为我们原稿完成了很多数据。参考文献1. 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